Методом тонкослойной хроматографии

Тонкослойная хроматография – это эффективный, преимущественно аналитический метод быстрого разделения низкомолекулярных веществ: липидов, аминокислот, нуклеотидов, витаминов и др. Исследуемый образец наносят на тонкий слой силикагеля, закрепленного на пластинке из фольги, пластика или стекла. Пластинку помещают в хроматографическую камеру с небольшим количеством растворителя. Фронт растворителя поднимается по пластинке под действием капиллярных сил, увлекая вещества, содержащиеся в образце. Скорость продвижения разделяемых веществ зависит от их распределения между неподвижной (гидрофильный силикагель) и подвижной (неполярный растворитель) фазами и растворимости в последней. Хроматографический процесс заканчивают в тот момент, когда растворитель достигает верхнего края пластинки. Пластинку с силикагелем высушивают, анализируемые вещества проявляют с помощью соответствующих красителей. Для каждого вещества разделенного образца рассчитывают величину R_f. Полученные значения R_f сравнивают со значениями R_f контрольных веществ (свидетелей) и идентифицируют соединения, присутствующие в образце.

Приготовление пластинок.. Пластинки тонкого закрепленного слоя силикагеля готовят заранее следующим образом.

Стеклянные пластинки (лучше фотопластинки) размером 17,5 · 13 см тщательно моют свежеприготовленной хромовой смесью и ополаскивают много раз водопроводной водой, затем 3–5 раз дистиллированной, вытирают чистой марлей, протирают этиловым спиртом и хранят в чистом полиэтиленовом пакете в отдельной коробке.

Неподвижной фазой при разделении служит силикагель KСK, для закрепления силикагеля используют химически чистый гипс – CaSО₄. Силикагель измельчают в шаровой мельнице с фарфоровыми шарами. Шары предварительно моют соляной кислотой и водой. Обычно 1 кг силикагеля перемалывают около 5 ч. Затем силикагель просеивают через металлическое или капроновое сито (100–200 меш) и хранят в склянке с притертой пробкой. (Размеры частиц адсорбента, силикагеля определяют условными единицами меш. По числу меш, приходящихся на 2,54 см длины сита, определяют размеры отверстий сита. При 50 меш размеры отверстий будут равны 0,254 мм, при 60 – 0,211, при 150 – 0,084, при 200 – 0,063 мм. Поэтому для получения определенного размера частиц используют соответствующие сита). Гипс также размалывают или растирают в ступке и просеивают через сито.

Для приготовления сорбционной массы 6 г силикагеля и 0,35 г гипса энергично встряхивают 3–5 мин в колбочке (можно с резиновой пробкой, защищенной пленкой). Смесь высыпают в ступку, постепенно, при тщательном растирании, небольшими порциями по 3–5 мл добавляют дистиллированною воду – всего 15–17 мл. Смешивание силикагеля и гипса с водой заканчивают в течение 1,5–2 мин (следить по секундомеру). Полученная масса должна быть однородной и без пузырьков воздуха.

Готовую смесь тонкой непрерывной струей выливают в центр пластинки и покачиванием пластинки распределяют ее ровным слоем по всей поверхности. Пластинку сушат при комнатной температуре 24 ч на столике с уровнем, а затем активируют в сушильном шкафу при 105 °С в течение 40 мин. Если пластинки не используют сразу, их хранят в эксикаторе над CaCl₂.

Подготовка хроматографической камеры. Разгонку общей фракции липидов проводят смесью растворителей гексан – диэтиловый эфир – ледяная уксусная кислота в соотношении 78: 25: 2 или гексан–диэтиловый эфир–муравьиная кислота в соотношении 80: 80: 2 в любом герметически закрытом сосуде с плоским дном. (Крышку можно притирать к краю стенки сосуда смазкой.) Стенки камеры для лучшего насыщения выстилают фильтровальной бумагой и в камеру наливают смесь растворителей. Во время разгонки бумага на вид должна быть сухая. Следите, чтобы она не погружалась в растворитель, иначе последний будет перетекать на пластинку. Плотно закрытую камеру оставляют на 2–3 ч для насыщения парами растворителя.

Нанесение экстракта на пластинку. Липиды, выделенные из тканей, растворяют в 1 мл хлороформа. Хлороформный экстракт липидов наносят на пластинку с помощью микропипетки. Линия старта должна быть на расстоянии 1,5 см от нижнего края пластинки, расстояние между точками нанесения 1–2 см (не менее). Раствор наносят очень маленькими каплями, не прикасаясь пипеткой к пластинке, либо в одну точку, либо узкой горизонтальной полоской (8 мм), капля к капле. Общий объем наносимого экстракта–0,05–0,1 мл.

На эту же пластинку в отдельные точки наносят свидетели: 1 % хлороформные растворы холестерина, фосфатидилэтаноламина и триацилглицеринов (свиное сало) в количестве 0,04–0,05 мл. Величина R_f зависит от количества нанесенного на пластинку вещества, (лучший результат достигается при нанесении на пластинку 0,5–1,0 мг вещества). В случае необходимости разделения больших количеств веществ можно использовать препаративное разделение липидов методом тонкослойной хроматографии. Этим способом можно разделить 50 мг и более смеси веществ.

Разделение и проявление. После нанесения липидов пластинку помещают в камеру, погружая ее в растворитель на 5 мм. Камеру герметически закрывают. Разгонка продолжается 50–60 мин при комнатной температуре. Подъем жидкости не должен быть выше 10–12 см, так как при большом подъеме происходит диффузия пятен и наблюдается колебание величины R_f. После разгонки пластинку высушивают на воздухе в течение 30 мин. Хроматограмму проявляют, осторожно опрыскивая из стеклянного пульверизатора 10 % спиртовым раствором фосфомолибденовой кислоты, и затем, через 1–2 мин выдерживают ее в сушильном шкафу при температуре 80–100 °С до появления на желтом фоне синих пятен липидов. Избыток проявителя может привести к заметному увеличению окраски фона.

Расположение липидов на хроматограмме следующее: отчетливо обнаруживаются 7–8 пятен. В первом пятне у старта находятся фосфоглицериды, выше – не идентифицированные соединения, в третьем пятне содержится холестерин, затем моно-, ди-, триацилглицерины соответственно, в последнем пятне – эфиры холестерина. Между ди- и триацилглицеринами располагаются свободные жирные кислоты, но они не проявляются фосфомолибденовой кислотой (проявители свободных жирных кислот: родамин или 0,2 % спиртовой раствор 2,6-дихлорфлуоресцина в ультрафиолете). Вместо фосфомолибденовой кислоты можно использовать способ проявления липидов в парах йода. В последнем случае проявляются все липиды. Для этого сухую пластинку помещают на несколько минут в закрытый сосуд (можно эксикатор), наполненный кристаллами йода (под тягой!).