И количественное определение общих ганглиозидов
Данные по содержанию ганглиозидов в головном мозгу долгое время были крайне разноречивыми, что объяснялось отсутствием точного метода количественного определения ганглиозидов в нервной ткани. Разрабатываемые методы количественной оценки ганглиозидов основывались на определении одного из компонентов, входящих в их молекулы, а так как эта молекула многокомпонентна, то становятся понятными и причины расхождений.
Впервые количественный метод определения ганглиозидов, основанный на колориметрическом определении нейраминовой кислоты с реактивом Биаля, был разработан Е. Кленком и Е. Лангербейнсом. Они использовали свойство определенных гликолипидов давать фиолетовое окрашивание с орцином. Но поскольку орцин был предложен для оценки пентоз и гексоз, то присутствующие в нем углеводы мешали образованию окраски с нейраминовой кислотой. Это делало орциновый метод неспецифичным и малочувствительным. Л. Свеннерхольм заменил орцин резорцином, и чувствительность метода сильно возросла.
Определение ганглиозидов по галактозамину, предложенное Х. Эдгаром, встретило ряд существенных возражений. Л. Свеннерхольм показал, что содержание галактозамина в ганглиозидах мозга с возрастом уменьшается. Кроме того, минорные ганглиозиды не содержат в своем составе галактозамина. Определение ганглиозидов по гексозам антроновым методом Промыслова могло давать завышенные величины, так как окраску с антроном образуют не только галактоза и глюкоза, но и аминосахара. Кроме того, требовалась особая степень очистки полученных ганглиозидов от других нейтральных глико- и аминогликолипидов.
Все современные методы количественного определения ганглиозидов основаны на определении содержания N-ацетилнейраминовой кислоты – самого специфического и характерного их компонента.
Для количественного определения нейраминовой (сиаловой) кислоты существует несколько методов, основанных на цветных реакциях с орцином, дифениламином, диметиламинобензальдегидом, триптофан-хлорной кислотой, со смесью серной и уксусной кислот. Почти все они являются модификациями методов, применяемых для определения сахаров и аминосахаров. Эти методы недостаточно чувствительны, малоспецифичны и редко используются для непосредственного определения N-ацетилнейраминовой кислоты.
Наиболее широкое применение для оценки сиаловых кислот получил резорциновый метод Свеннерхольма, который в сочетании с очисткой на ионообменных смолах от сопутствующих углеводных компонентов представляет собой надежный и чувствительный метод определения общей N-ацетилнейраминовой кислоты. Были разработаны тиобарбитуровый, периодат-резорциновый и периодат-тиобарбитуровый методы определения содержания N-ацетилнейраминовой кислоты, из которых два последних сочетают в себе преимущества тиобарбитурового и резорцинового методов и поэтому нашли широкое применение в количественном определении как гликолипидов, так и гликопротеинов. Чтобы оценить содержание N-ацетилнейраминовой кислоты в ганглиозидах указанными выше методами, необходимо иметь в качестве стандарта чистую N-ацетилнейраминовую кислоту.
Резорциновый метод
Принцип метода: при нагревании сиаловых кислот, как свободных, так и гликозидносвязанных, с резорцином в присутствии минеральных кислот образуется хромоген. Структура этого хромогена пока неизвестна, предполагают, что хромоген содержит фурфуроловые или пиррольные производные, которые реагируют с резорциновым реактивом.
Реактивы: 1) концентрированная НС1; 2) 0,1 M раствор CuSO4; 3) 200 мг резорцина; 4) стандартный раствор N-ацетилнейраминовой кислоты, содержащий от 10 до 60 мкг кислоты; 5) изоамиловый спирт или смесь н -бутанол – н -бутилацетат (15: 85).
Резорциновый реактив готовят следующим образом: 200 мг перекристаллизованного резорцина растворяют в 80 мл концентрированной НС1, добавляют 0,25 мл 0,1 М раствора CuSO4 и объем доводят до 300 мл дистиллированной водой. Раствор используют не ранее чем через 4 ч после его приготовления, (в холодильнике реактив может храниться в течение недели).
Ход определения: к 2 мл водного раствора, содержащего сиаловые кислоты, прибавляют 2 мл резорцинового реактива. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и пробы ставят в постоянно кипящую водяную баню на 15 мин. При наличии в растворе N-ацетилнейраминовой кислоты в пробах развивается интенсивная красно-вишневая окраска. После охлаждения окрашенный комплекс экстрагируют изоамиловым спиртом или смесью н -бутанол – н -бутилацетат(15:85), добавляя в пробы по 5 мл каждого. Образовавшуюся интенсивно окрашенную в синий цвет верхнюю фазу отбирают пипеткой и фотометрируют на спектрофотометре при длине волны 580 нм. Полученную экстинкцию по калибровочной кривой переводят в микрограммы N-ацетилнейраминовой кислоты. Чувствительность резорцинового метода Свеннерхольма составляет 10–40 мкг нейраминовой кислоты.