Принцип метода: одной из трудностей в изучении ганглиозидов является отсутствие относительно простого метода получения чистых соединении из тканевых экстрактов. Р. Блике, а затем К. Кленк впервые разработали метод выделения ганглиозидов головного мозга, основанный на избирательной экстракции их органическими растворителями. Этим способом авторы получали почти чистые ганглиозиды, но с большими потерями, что было нежелательно, если принять во внимание относительно небольшое содержание и гетерогенность ганглиозидов. В тканях ганглиозиды ассоциированы с белками, поэтому во всех методах их выделения используются сильнополярные растворители и в основном экстракцию липидов из ткани осуществляют смесью хлороформа с метанолом, как это было предложено Дж. Фолчем с сотрудниками. В распределительном методе ганглиозиды выделяли из общего липидного экстракта диализом против воды, при этом использовалась особенность ганглиозидов переходить в водный раствор из органических растворителей. При диализе полученного экстракта против воды (процедура распределения) ганглиозиды переходят в верхний водный слой, в то время как основная масса других липидов остается в нижнем хлороформном слое.
В модифицированном Л. Свеннерхольмом варианте распределения вместо воды применяют слабый солевой раствор. Этот метод используют обычно в тех случаях, когда достаточно получить небольшое количество ганглиозидов. Тканевую экстракцию ганглиозидов можно проводить не только смесью хлороформа с метанолом, но и другими растворителями. Так, Н. Трамс и Д. Лаутер предложили экстрагировать ганглиозиды из мозга тетрагидрофураном, а К. Кун и С. Вигандт применили для этих целей фосфатный буфер и фенол. Экстракция тетрагидрофураном заслуживает некоторого предпочтения перед другими растворителями. Тетрагидрофуран увеличивает выход ганглиозидов на 8–15 % и способствует более полному выделению мультисиалоганглиозидов. Кроме того, тетрагидрофурановый метод в отличие от метода Фолча гарантирует выделение ганглиозидов, свободных от гликопротеинов, хотя дополнительно требует удаления фосфолипидов на колонке с силикагелем. Т. Сузуки улучшил метод Фолча, использовав для экстракции ганглиозидов смесь хлороформ – метанол в различных соотношениях. Тем самым была устранена неполная экстракция в водную фазу менее полярных ганглиозидов. Независимо от способа экстракции во всех случаях получается смесь индивидуальных ганглиозидов.
Для микроопределений ганглиозидов головного мозга используется модификация метода Фолча по Свеннерхольму и Сузуки.
Реактивы: 1) хлороформ; 2) метанол; 3) 0,1 % и 0,9 % растворы NaCl; 4) 0,1 М ЭДТА; 5) металлический натрий; 6) концентрированная НС1; 7) 0,8 М раствор СН3СООNа; 8) 0,2 М раствор NaOH.
Ход работы: после декапитации крысы головной мозг извлекают из черепной коробки, освобождают от кровеносных сосудов, промывают охлажденным 0,9 % раствором NaCl, обсушивают фильтровальной бумагой и взвешивают. Мозг гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе с 5 мл смеси хлороформа с метанолом (2:1) в течение 3 мин, гомогенат переносят в широкую пробирку с притертой пробкой и разводят этой же смесью из расчета 20 мл смеси на 1 г ткани. Экстракцию общих липидов осуществляют при 40 °С в течение 30 мин, время от времени встряхивая пробирки. Липидный экстракт фильтруют в цилиндр на 50 мл через складчатый бумажный фильтр, предварительно обработанный смесью хлороформа с метанолом. Ткань обрабатывают повторно хлороформ-метаноловой смесью (1:2) для более полного извлечения ди- и трисиалоганглиозидов. Объединенные хлороформ-метаноловые экстракты выпаривают под вакуумом, а осадок растворяют в первоначальном объеме хлороформа с метанолом (2:1). Нерастворившуюся часть отфильтровывают, а фильтрат подвергают дальнейшей обработке для выделения ганглиозидов.
Дж. Фолч с соавторами установили, что при обработке хлороформно-метанолового экстракта мозга разбавленными солевыми растворами образующаяся верхняя фаза содержит все ганглиозиды тканевого экстракта. К фильтрату добавляют 0,1 % раствор NaCl из расчета 0,2 мл на 1 мл липидного экстракта. Л. Свеннерхольм показал, что 0,1 % раствор NaCl более предпочтителен, чем предложенный Э. Сперри 0,02 % раствор СаСl. Добавление раствора KСl давало почти в два раза более низкий выход липидносвязанной N-ацетилнейраминовой кислоты.
После прибавления раствора NaCl пробирку плотно закрывают притертой пробкой и энергично встряхивают до образования белой эмульсии, которую оставляют на ночь в холодильнике. За это время эмульсия, как правило, разделяется на две четкие фазы: верхнюю – водно-метаноловую и нижнюю – хлороформную. Если расслоение не произошло, пробы центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин, после чего верхний водно-метаноловый слой, содержащий ганглиозиды, осторожно отсасывают и переносят в чистую пробирку. Для более полной экстракции ганглиозидов из нижней хлороформной фазы производят многократную дополнительную экстракцию ганглиозидов специально составленной смесью воды, метанола и хлороформа в соотношении 47: 48: 3. Смесь добавляют небольшими порциями к хлороформной фазе и повторяют все процедуры от образования эмульсии до ее разделения на 2 слоя, как при первой экстракции ганглиозидов 0,1 % раствором NaCl.
Присутствие ганглиозидов в верхней и нижней фазах обнаруживают по наличию в них N-ацетилнейраминовой кислоты нижеприведенным методом. Нижний хлороформный слой после 3-кратного промывания, как правило, не содержит N-ацетилнейраминовой кислоты и используется для определения цереброзидов и сульфатидов (см. с. 22).
Объединенный водно-метаноловый раствор, содержащий ганглиозиды, очищают от NaCl и других нелипидных водорастворимых низкомолекулярных примесей при помощи диализа в целлофановом мешочке сначала против 0,1 М ЭДТА, а затем против большого количества дистиллированной воды. Диализ осуществляют в течение 2–3 сут при 4 °С, меняя воду в диализаторе 2–3 раза в сутки.
Очищенный диализом водный раствор ганглиозидов подвергают лиофилизации. Использование лиофилизации позволяет предотвратить частичное термическое разрушение ганглиозидов, неизбежное при всех видах выпаривания раствора.
Полученный после лиофилизации белый пушистый порошок ганглиозидов растворяют в минимальном объеме смеси хлороформа с метанолом (2:1). Осадок, состоящий из денатурированного белка и неидентифицированных полимеров, устраняют центрифугированием или фильтрованием, а растворимую фракцию подвергают дальнейшей очистке от нейтральных липидов, фосфолипидов, сульфатидов.
Освобождение верхней фазы после лиофилизации от фосфолипидов и сульфатидов осуществляют по методу Канфера. Для этого производят выпаривание растворимой хлороформ-метаноловой фракции и полученный осадок растворяют в 10 мл метанола, к которому добавляют несколько капель метилата натрия, приготовленного растворением небольшого количества металлического натрия в метаноле, причем раствор должен иметь рН 9,5–10,5. Раствор оставляют при комнатной температуре на 30 мин, после чего добавляют смесь метанол-НС1 до рН среды, равного 2,0. Затем в раствор вводят 23 мл хлороформа, хорошо перемешивают и добавляют 6,8 мл 0,1 % раствора NaCl. Смесь энергично встряхивают и после центрифугирования верхнюю фазу удаляют и сохраняют. Проводят еще две дополнительные промывки смесью хлороформ – метанол – вода (3: 48: 47). Объединенные верхние фазы концентрируют на роторном испарителе до 10 мл и диализируют против дистиллированной воды. В результате очистки раствор освобождается от фосфолипидов и сульфатидов.
Полученный после диализа раствор лиофилизируют, осадок растворяют в 50 мл смеси хлороформ – метанол – вода (30: 60: 8) и наносят на колонку с анионитом. В колонку размером 20 · 1,5 см вводят 2,2 г ДЕАЕ-сефадекса А-25, промытого несколько раз раствором метанол – хлороформ – 0,8 М CH3COONa (30: 60: 8) с последующим уравновешиванием этим же раствором. Такая обработка переводит смолу из хлоридной в ацетатную форму, что создает условия для работы с органическими растворителями. Смолу промывают несколько раз примерно 100–200 мл раствора хлороформ – метанол – вода (30: 60: 8).
На колонку наносят раствор ганглиозидов, после медленного пропускания образца колонку элюируют 150 мл того же растворителя, чтобы удалить все незаряженные примеси. Затем ганглиозиды элюируют 180 мл смеси метанол – хлороформ – 0,8 M CH3COONa (60: 30: 8). Растворитель удаляют выпариванием, а к осадку добавляют 10–20 мл 0,2 н. NaOH в СН3ОН и проводят инкубацию в течение 1 ч при 37 °С, периодически встряхивая. Затем раствор выпаривают до 1/4 от первоначального объема, добавляют избыток воды и пробы диали-зируют против дистиллированной воды в течение 2 сут. Содержимое диализационного мешочка лиофилизируют. Полученные таким образом ганглиозиды проверяют на присутствие фосфора, холестерина и белка. Если ни одно из перечисленных соединений не обнаружено, это дает основание считать ганглиозиды чистыми. Чистые ганглиозиды головного мозга могут использоваться далее для количественной оценки и хроматографического разделения на тонком слое на индивидуальные ганглиозиды.