УНИВЕРСИТЕТ»
Естественно-технологический институт
Кафедра биохимии и микробиологии
Реферат
«Принципы иммуноферментного анализа, основные виды ИФА, применение в диагностике»
Выполнил:
Студент 1 курса
направления 06.04.01 «Биология»
магистерской программы
«Микробиология и вирусология»
Иванова Е.Г.
Проверил:
Зав. кафедрой биохимии, профессор, кандидат химических наук, Заслуженный работник науки и образования РАЕ
Овчинникова С.И.
Мурманск
Введение
Методы иммунного анализа широко вошли в медицинскую практику. Во всех областях современной медицины используется иммунный анализ, преимущественно, с диагностической и аналитической целями. Особенно важно, что они дают возможность идентифицировать биологические компоненты (гормоны, ферменты, нейропептиды, продукты иммунной системы, антигены и т.д.) в низких и очень низких концентрациях.
Иммунный анализ основывается на взаимодействии антигена (АГ) и антитела (АТ) с использованием различных вариантов мечения одного из компонентов (фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель и другие). Оценка реакции проводится автоматически на специальной аппаратуре, что позволяет стандартизировать эти методы.
В зависимости от типа используемой метки и условий постановки теста иммунный анализ обозначается как иммуноферментный (ИФА), радиоиммунный (РИА), иммунофлуоресцентный и другие. При постановке реакций в один или несколько этапов они обозначаются как прямые или непрямые. Имеет значение среда, в которой проводится реакция. Если реакция проводится с реагентами, фиксированными на поверхности, то тест обозначается как твердофазный, например ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).
Иммуноферментный анализ.
ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для идентификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодифузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участия Е. Энгвалл и Р. Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р. Шурс.
Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результатереакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически (рис. 1).
Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины.
Появление моноклональных антител послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов.
Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии. Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции.
Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.
Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:
1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;
2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;
3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.
Классификация ИФА
В основу классификации методов ИФА положено несколько подходов:
1. По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и неконкурентный методы.
А) В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментном и конкурирующий за центры специфического связывания с ним.
Б) Для неконкурентных методов характерно присутствие в системе на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.
2. Все методы ИФА делятся на гомогенные и гетерогенные.
Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов, метод относится к группе гомогенных.
В основе гомогенного ИФА, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. Активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело.
При связывании антитела с антигеном, содержащим ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95% по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена связывается все больше антител и сохраняется все больше свободных конъюгатов антиген-фермент, способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат. Анализ проводят очень быстро, для одного определения требуется 1 минута. Чувствительность метода достаточно высока. С его помощью можно определить вещество на уровне пикомолей.
Для гетерогенных методом характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы - носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы - в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами.
Методы относятся к гомогенно- гетерогенным, если 1 стадия - образование специфических комплексов происходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу с иммобилизированным реагентом.
3. По принципу определения тестируемого вещества:
А) Прямое определение концентрации вещества (антигена или антитела) по числу провзаимодействующих с ним центров связывания. В этом случае ферментная метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу.
Б) Определение концентрации вещества по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала.
Характеристика компонентов, используемых в ИФА
Ферменты. Ферментные метки обладают чрезвычайно мощьным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов, катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тиразина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.
Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами:
- высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками;
- наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции;
- возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению;
- отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости.
В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ). Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.
Субстраты. Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична.
Основные требования к субстрату:
- обеспечение высокой чувствительности метода при выявлении фермента в конъюгате;
- образование хорошо учитываемых (например, окрашенных) продуктов реакции фермент-субстрат;
- субстрат должен быть безопасным, дешевым, доступным и удобным для применения.
Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образуют окрашенное вещество. Перспективным является использование высокоэнергетических субстратов - флуоресцентных, хемилюминесцентных. Применение таких субстратов позволяет теоретически повысить чувствительность ИФА на два порядка.
Антигены и антитела. АГ и AT, используемые в ИФА, должны быть высокоочишенными и высокоактивными. Кроме того, АГ должны обладать высокой антигенностью, оптимальной плотностью расположения и количеством антигенных детерминант, чужеродностью и гомогенностью. Многие синтетические и рекомбинантные АГ вирусов и бактерий хорошо себя зарекомендовали при использовании в ИФА. Это существенно повысило специфичность и воспроизводимость метода за счет сведения к минимуму перекрестных реакций.
Одним из наиболее важных реагентов в ИФА являются антитела. Чувствительность ИФА зависит от концентрации, активности и специфичности используемых антител. Используемые антитела могут быть поли- или моноклинальными, различного класса (IgG или IgM) и подкласса (IgGl, IgG2), антиаллотипическими или антиидиотипическими. При низкой аффинности AT распад комплекса АГ-АТ приводит к удалению связанного АГ из системы. Чувствительность и специфичность метода повышается при использовании моноклональных антител. В этом случае появляется возможность обнаруживать низкие концентрации АГ (AT) в испытуемых образцах.
Образование конъюгата. Конъюгат - это антиген или антитело, меченные ферментной меткой. Образование коньюгата - один из важных этапов проведения ИФА.
При формировании конъюгата подбирают такой оптимальный метод введения ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою биологическую активность: фермент - способность взаимодействовать с субстратом, а антиген или антитело - антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно. Наличие меченого, высокоочищенного антигена позволяет использовать конкурентные методы. В этом случае на конечном этапе можно измерять активность конъюгата, не связанного с иммобилизованными антителами, что позволяет избежать процедуры отмывки и делает анализ более удобным. Однако антигены разнообразны по своим физико-химическим свойствам и строению, а значит невозможно разработать универсальные методики для получения конъюгата с антигеном. В этом случае получение конъюгата антигена с ферментом представляет собой отдельную сложную задачу. Приготовление меченых антител для ИФА методически более доступно.
Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками производится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с АГ или AT и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и АГ или AT осуществляется иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело.
Существует одноэтапный и двухэтапный методы получения конъюгатов с помощью глутарового альдегида.
В результате двухэтапного синтеза, который заключается в поэтапном получении сначала модифицированного с помощью сшивающего агента фермента, его выделении, а затем последующем взаимодействии его с антигеном (антителом), образуются молекулы однородного состава, содержащие 1-2 молекулы фермента на молекулу иммуноглобулина и сохраняющие высокую ферментативную и иммунологическую активность. Однако количество таких образовавшихся конъюгатов невелико (для пероксидазы хрена составляет 5 - 10 %).
Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов, основанный на окислении углеводного компонента фермента периодатом натрия (связывание пероксидазы в конъюгат достигает 70-90 % от начального количества фермента).
Надежный конъюгат должен обладать следующими свойствами:
- высоким антительным тигром и высокой афинностью к антигену, чтобы его можно было использовать в большом разведении, и таким образом, уменьшить неспецифическое связывание;
- достаточной специфичностью в рабочем разведении;
- преобладанием мономерных форм над полимерными, т.к. полимерные формы имеют тенденцию к неспецифической адгезии на пластике, что приводит к высокому фоновому уровню реакции;
- оптимальным молярным соотношением между ферментом и антителами (оптимальное соотношение составляет около 1:1);
- достаточной ферментативной активностью конъюгата. Это свойство определяется главным образом условиями конъюгации и соотношением молекул фермента и антител в конъюгате.
Твердая фаза. В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различные материалы: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен и другие вещества. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планшеты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки.
Иммобилизация антигена или антител на твердой фазе возможна тремя путями:
- пассивная адсорбция, основанная на сильных гидрофобных взаимодействиях между белками и синтетической поверхностью;
- ковалентное прикрепление к твердой фазе;
- иммунохимическое и др. (нековалентное и неадсорбционное присоединение).
Свободные сайты на поверхности твердой фазы, не связавшиеся с сорбируемым агентом, могут фиксировать в ходе теста другие молекулы, в том числе и конъюгаты, что приводит к повышению фонового сигнала. Для предотвращения неспецифического связывания после иммобилизации на твердую фазу основного материала проводят обработку нейтральными для теста веществами. Наиболее популярные блокирующие агенты - бычий сывороточный альбумин (БСА), казеин и др. Выбор блокирующего агента и условия проведения этого этапа зависят от типа твердой фазы, чувствительности системы.
Варианты постановки ИФА
Для выявления антител к различным антигенам вирусов гепатитов А, В, С и D применяются разнообразные варианты постановки ИФА, основными из которых являются:
1. Метод с использованием меченых вторичных антител (антител против иммуноглобулинов человека) и иммобилизированных антигенов на твердой фазе. Метод применяется для определения антител к вирусу гепатита С. Общая схема проведения реакции заключается в следующем (рис. 21): на твердой фазе иммобилизуют антиген, после инкубации исследуемого материала и удаления несвязавшихся компонентов добавляют меченые ферментом антитела к иммуноглобулинам человека класса IgG, которые взаимодействуют с Fc-фрагментом анти-ВГС. После проведения субстрат-ферментативной реакции проводят учет полученных результатов. При наличии антител уровень оптической плотности прошедшей реакции превосходит показатели отрицательных образцов. Для уменьшения возможных неспецифических реакций вводится специальный коэффициент, указанный в наставлениях, прилагаемых к диагностическим наборам.
2. Метод с использованием меченого антигена и иммобилизованного на твердой фазе антигена. Метод используется для выявления анти-HBs в диагностическом наборе “AUSAB” EIA фирмы “ЭББОТТ”. Общая схема проведения реакции заключается в следующем (рис. 22): на полистироловом шарике адсорбирован HBsAg субтипа ad и ау, после инкубации с исследуемым материалом и удаления непрореагировавших компонентов добавляется HBsAg, меченный ферментом, который взамодействует со свободными центрами связывания антител к HBsAg, провзаимодействовавшими с антигеном, сорбированным на твердой фазе. При наличии антител в исследуемой пробе уровень оптической плотности прошедшей реакции превосходит показатели отрицательных контрольных образцов.
3. Метод с использованием меченых и иммобилизованных антител, а также стандартного антигена. Этот вариант метода применяют для выявления анти-HBs и анти-НВе с диагностикумами фирмы (“ДИАплюс”). Общая схема проведения реакции заключается в следующем (рис. 23): на первом этапе реакции исследуемый образец смешивают с раствором, содержащим фиксированное количество антигена. После завершения инкубации добавляют шарик с сорбированными на нем антителами и коньюгат. После удаления непрореагировавших компонентов реакции проводится ферментативная реакция, интенсивность которой обратно пропорциональна содержанию исследуемых антител в образце. Вариантом этой схемы может служить определение анти-НВе и анти-дельта с диагностикумами фирмы “ЭББОТТ”, когда компоненты реакции добавляются последовательно.
4. Метод с использованием меченых антител и иммобилизованного антигена (конкурентный метод). Данная схема широко применяется для выявления анти-HBs, анти-НВс и анти-ВГА. Общая схема проведения реакции заключается в следующем (рис. 24): к антигену, иммобилизованному на твердой фазе одновременно добавляют исследуемый материал и коньюгат. При проведении реакции меченые и исследуемые антитела конкурируют за активные центры антигена, иммобилизованного на твердой фазе. После завершения инкубации и удаления не прореагировавших компонентов проводится ферментативная реакция, результаты которой обратно пропорциональны количеству антител в исследуемом образце. При использовании набора фирмы (“ДИАплюс”) при выявлении анти-HBs, в случае наличия HBsAg уровень ферментативной реакции будет превосходить результаты реакции в негативных образцах, что позволяет косвенно судить о наличии антигена.
5. Метод выявления антител класса IgM - многослойный “сэндвич” метод. Этот метод применяется для выявления анти-НВс IgM и анти-ВГА IgM. Общая схема проведения реакции заключается в следующем (рис. 25): на твердой фазе адсорбированы антитела к мю-цепям иммуноглобулинов класса М, которые взаимодействуют с антителами класса IgM, находящимися в исследуемой сыворотке. После удаления непрореагировавших компонентов добавляется стандартное количество антигена, антитела против которого определяются. Удалив непрореагировавшие компоненты реакции, добавляют меченые антитела, реагирующие с антигеном. Также, как и в обычном “сэндвич”-методе, чем больше количество антител, тем интенсивней ферментативная реакция. Для уменьшения ложнопозитивных результатов исследование сывороток крови проводится после их разведения в 1000 раз.