Для решения поставленных задач был проведен ретроспективный анализ историй родов 532 женщин в возрасте 31,7±4,5 лет с хирургической коррекцией ИЦН за 3 года (с 01 января 2004 по 31 декабря 2006г включительно) в ФГУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития.
При проспективном исследовании нами было обследовано 140 женщин 31,3±5,2 лет, которые обратились в научно-поликлиническое отделение ФГУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» и находились на стационарном лечении (Х-2006 - V-2009гг) по поводу хирургической коррекции ИЦН.
Контрольную группу для проспективной серии наблюдений составили 30 первобеременных (после 20 нед беременности) женщин с физиологическим течением беременности в возрасте 29,2±3,6лет.
Генетическое исследование маркеров нарушений соединительной тканибыло проведено 83 пациенткам основной группы.
Контрольную группу для генетического исследования составили 117 женщин –родильницы, беременность которых протекала без признаков ИЦН.
При анализе использовалась балльная оценка степени выраженности дисплазии соединительной ткани (Т.Ю. Смольнова, 2004).
Критерии включения в проспективную группу исследований:
- Женщины с самопроизвольной одноплодной беременностью
-Наличие истмико-цервикальной недостаточности по данным мануального и ультразвукового исследований
Критерии исключения:
-Женщины с дифференцированными формами дисплазии соединительной ткани (синдромы Эллерса-Данло, Морфана, Рендю-Ослера)
-Многоплодная беременность
- Пороки развития плода
Всем беременным было проведено тщательное клинико-анамнестическое, клинико-лабораторное (в том числе ультразвуковое, УЗ-допплерометрическое, кардиотокографическое, гемостазиологическое, гормональное, биохимические, вирусологические, микробиологические), а также специальные методы исследования, к которым относятся:
|
|
1. Генотипирование
Выделение ДНК проводили по методу Higuchi (R.Higuchi, H.Erlich, 1989) с некоторыми модификациями. 0,5 мл крови, взятой с ЭДТА в качестве антикоагулянта, смешивали в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках типа Эппендорф с 0,5 мл лизирующего раствора, состоящего из 0,32М сахарозы, 10 мМ Трис-HCl рН 7,5, 5 мМ MgCl, 1% Тритона Х-100, центрифугировали в течении 1 мин. при 10000 об/мин, супернатант удаляли, а осадки клеточных ядер два раза отмывали указанным буфером. Последующий протеолиз проводили в 50 мкл буферного раствора, содержащего 50мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl рН 8,3, 2,5мМ MgCl, 0,45% NP40, 045% Твина 20 и 250 мкг/мл протеиназы К при 37°С в течение 20 мин. Инактивировали протеиназу К при 98°С в течение 20 мин. Полученные образцы ДНК до типирования хранили при -20°С. Концентрация ДНК определенная на ДНК-минифлуориметре (Ноеfer, США) составляла в среднем 50-100 мкг/мл.
Определение замен одиночных нуклеотидов проводили модифицированным методом «примыкающих проб» (adjacent probes, kissing probes), используя оригинальные олигонуклеотидные праймеры.
При идентификации замен одиночных нуклеотидов вначале проводили ПЦР с праймерами, общими для обоих вариантов нуклеотидной последовательности, затем понижали температуру реакционной смеси для гибридизации полученной матрицы с олигонуклеотидными пробами. Для определения варианта последовательности использовали два типа олигонуклеотидов, гибридизующихся на матрицу рядом. Первый тип олигонуклеотидов был помечен флуорофором, второй – гасителем флуоресценции.
|
|
Для предотвращения неспецифического отжига праймеров и повышения чувствительности тест-систем использовали Taq-полимеразу блокированную специфическими антителами.
В ходе генотипирования использовали один общий олигонуклеотид с гасителем флуоресценции и два сиквенс-специфичных олигонуклеотида несущих различные флуорофоры. Олигонуклеотидные пробы, соответствующие тому или иному варианту последовательности метили различными флуорофорами, что позволило определять оба варианта в одной пробирке. После поведения ПЦР и гибридизации измеряли уровень флуоресценции в ходе температурной денатурации дуплексов олигонуклеотидов и полученных матриц в режиме реального времени. Определение генотипа проводили путем анализа кривых плавления. Если анализируемый образец содержал только один вариант нуклеотидной последовательности гена, т.е. был гомозиготен по данному полиморфизму, температура плавления для пробы образующей совершенный дуплекс была существенно выше, нежели для пробы образующей несовершенный дуплекс. Если же анализировали гетерозиготный образец, содержащий оба варианта нуклеотидной последовательности, каждый из вариантов проб мог образовать совершенный дуплекс, поэтому температуры их плавления были практически одинаковы.
Полимеразную цепную реакцию и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводили с помощью детектирующего амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).
2. Определение уровней содержания матриксных металлопротеиназ производилось с помощью методов электрофореза (качественный анализ) иммуно-ферментного анализа (количественный анализ). Забор крови производили следующим образом: у пациенток натощак из локтевой вены брали 5,0 мл крови. Кровь центрифугировалась в течение не более 10 минут с момента взятия образца при 2800 оборотах в минуту. Сыворотку крови отбирали в пробирки типа Эппендорф объемом 1,5 мл и хранили до проведения исследования при температуре -70°С. Для стандартизации данных, учитывая, что матриксные металлопротеиназы являются протеолитическими субстратами, нами были использованы уровни протеинемии на момент взятия проб.
|
|
3. Биохимические исследования определения уровня магния в периферической крови выполнены в лаборатории клинической биохимии ФГУ «НЦАГиП им В.И.Кулакова Росмедтехнологий». Исследования осуществлялись на биохимическом анализаторе «Коне Ультра» (Финляндия) с использованием стандартных компьютерных программ и реактивов.
4. Биохимические исследования определения уровня магния в слюне выполнены в лаборатории биохимии городской клинической больницы №67. Пациентки утром натощак (после двенадцатичасового периода без лекарственных препаратов), до чистки зубов поласкали ротовую полость дистиллированной водой и собирали слюну в объеме 5,0мл в стерильную пробирку. Образцы слюны хранились при температуре -20° С, соблюдая максимальный интервал хранения 5 дней. Исследования осуществлялись на биохимическом анализаторе «Коне Ультра» (Финляндия) с использованием стандартных компьютерных программ и реактивов.
Статистическая обработка данных: Статистическую обработку данных проводили с помощью программного продукта SPSS версии 15.0. Для определения статистической значимости различий частот аллелей и генотипов в различных группах применялся критерий Фишера. Для определения достоверности различий между выборками использован критерий U Манна Уитни для несвязанных совокупностей.
Для оценки влияния факторов риска было рассчитано отношение шансов (OR). Значение OR приведено с 95% доверительным интервалом. Расчет OR проводился с помошью свободно распространяемого программного продукта WINPEPI версии 9.7 (PEPI-for-Windows https://www.brixtonhealth.com, Abramson, J.H.)
Все анамнестические, клинические, лабораторные данные обрабатывались методом вариационной статистики.