1.Введение.
Серологические методы являются обязательным разделом лабораторной диагностики сыпнотифозной инфекции и изучения их эпидемиологии. Серологические реакции выполняются с применением видоспецифических антигенов и вследствие своей высокой специфичности имеют решающее значение для подтверждения риккетсиозной природы заболевания. Предлагаемые методические рекомендации составлены с целью унификации методик исследований с учетом опыта ряда риккетсиозных лабораторий России и зарубежных стран и в соответствии с рекомендациями Всемирной Организации Здравоохранения. Методы серологических исследований, приведенные в методических указаниях, обеспечены коммерческими препаратами.
2. Серологические методы диагностики эпидемического сыпного тифа и болезни Брилла (Брилла-Цинссера).
2.1. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Позволяет выявить антитела к возбудителю сыпного тифа в ранние, начиная с 5-7-го дня болезни, что придает ей особую ценность. В острый период болезни титры в РНГА колеблются от 1600 до 51200.
В основе реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) лежит специфическая агглютинация эритроцитов, сенсибилизированных риккетсиозным антигеном или иммуноглобулинами, в присутствии соответствующих групповых антител или антигенов.
2.1.1. РНГА с антигенным риккетсиозным эритроцитарным диагностикумом. РНГА с антигенным риккетсиальным эритроцитарным диагностикумом предназначена для обнаружения и титрования специфических антител риккетсиальной природы в исследуемых сыворотках людей.
Антигенный эритроцитарный диагностикум представляет собой лиофильно высушенную взвесь 3% формалинизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных гидролизованным антигеном (гаптеном) риккетсий.
|
К антигенному эритроцитарному диагностикуму прилагается лиофильно высушенная 6% взвесь несенсибилизированных (контрольных) формалинизированных эритроцитов барана, предназначенных для контроля исследуемых сывороток и истощения их от неспецифических гемагглютининов, последнее может проводиться и неформалинизированными эритроцитами. Для разведения ингредиентов реакции используют формалинизированный физиологический раствор (ФФР).
Последний представляет собой 0,85% раствор хлорида натрия (рН=7.0), к которому добавлен формалин из расчета 0,3 на 100 мл раствора хлорида натрия.
Ингредиенты реакции:
1) Исследуемая сыворотка или исследуемый антиген.
2) Антигенный риккетсиальный или иммуноглобулиновый риккетсиальный эритроцитарный диагностикум или антигены для РНГА.
3) Формалинизированные или негативные эритроциты барана.
4) Физиологический раствор, 1% раствор нормальной кроличьей сыворотки.
5) Формалин.
РНГА можно ставить как макрометодом в стандартных плексигласовых планшетах с лунками, так и микрометодом - в планшетах с лунками типа "U" микротитратора Такачи. При постановке реакции макрометодом эритроцитарный диагностикум и контрольные эритроциты используют в виде 1,5% взвесей. Для приготовления таких взвесей содержимое ампулы с эритроцитарным диагностикумом разводят в 2 мл, а содержимое ампулы с контрольными эритроцитами - в 4 мл ФФР.
При постановке реакции микрометодом антигенный риккетсиальный эритроцитарный диагностикум и контрольные эритроциты используют в виде 0,5% взвесей. Для приготовления таких взвесей содержимое ампулы с эритроцитарным диагностикумом разводят в 6 мл, а с контрольными эритроцитами - в 12 мл ФФР.
|
Исследуемые сыворотки перед постановкой РНГА инактивируют при +56 град. С в течение 30 минут и истощают эритроцитами барана. С этой целью вскрывают ампулу с контрольными эритроцитами, разводят ее содержимое в 4-12 мл ФФР (в зависимости от постановки макро- и микрометодом), после чего 5 мл полученной 1% взвеси эритроцитов центрифугируют в течение 5 минут при 2500-3000 об/мин. и надосадочную жидкость отсасывают. К осадку добавляют 1 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:10, перемешивают, выдерживают 30 минут при +37 град. С и центрифугируют в течение 5 минут при 2500-3000 об/мин. Надосадочную жидкость, представляющую собой истощенную сыворотку, исследуют в РНГА. Постановка РНГА.
Вначале готовят исходное разведение исследуемой сыворотки (1:25). С этой целью к 1 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:10, истощенной эритроцитами барана, добавляют 1,5 мл ФФР.
Для приготовления последующих разведений исследуемой сыворотки в 10 лунок горизонтального ряда планшета наливают по 0,4 (0,05) мл ФФР. В первую лунку добавляют 0,04 (0,05) мл исходного разведения (1:25) исследуемой сыворотки. После тщательного перемешивания переносят 0,4 (0,05) мл содержимого первой лунки во вторую, из второй переносят в третью 0,4 (0,05) мл и т.д. Из первой лунки 0,4 (0,05) мл смеси выливают. Затем в каждую лунку добавляют предварительно хорошо размешанного эритроцитарного диагностикума по 0,1 (0,025) мл, планшет встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Учет результатов реакции - спустя соответственно 4-5 или 2-3 часа. Постановка опыта должна сопровождаться следующими контролями:
|
1. Контроль исследуемой сыворотки на отсутствие неспецифических гемагглютининов: в лунку планшета наливают 0,2 (0,025) мл исследуемой сыворотки в исходном разведении 1:25, добавляют 0,2 (0,025) мл ФФР и 0,1 (0,025) мл контрольных эритроцитов.
2. Контроль эритроцитарного диагностикума на отсутствие спонтанной гемагглютинации: в 2 лунки, содержащие по 0,4 (0,05) мл ФФР, добавляют по 0,1 (0,025) мл эритроцитарного диагностикума.
3. Заведомо положительный контроль: постановка РНГА с тест-сывороткой к риккетсиям Провачека, прилагаемой к данной серии эритроцитарного диагностикума.
Учет результатов РНГА. Учет результатов реакции проводят по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов. Реакцию считают положительной (оценивают на "+"), если агглютинировавшие эритроциты выстилают дно лунки, образуя по форме перевернутый купол с ровным или фасеточным краем. Титром исследуемой сыворотки считают максимальное ее разведение, которое вызывает четкую агглютинацию эритроцитарного диагностикума. Реакцию считают отрицательной (оценивают на "-") при оседании эритроцитов на дно лунки в виде диска или компактного кольца с четким ровным краем. В сомнительных случаях реакцию оценивают на "+/-".
2.1.2. РНГА с препаратом на основе нативных эритроцитов.
При отсутствии коммерческого антигенного риккетсиального эритроцитарного диагностикума РНГА можно ставить с нативными эритроцитами барана, предварительно сенсибилизированными коммерческим антигеном (гаптеном) риккетсий для реакции гемагглютинации. Антиген растворяют в физиологическом растворе (рН=7,0) в соответствии с указаниями на этикетке ампулы. 4 мл растворенного антигена смешивают с 0,1 мл осадка отмытых эритроцитов барана, выдерживают смесь в течение 1 часа при +37 град. С, встряхивая каждые 15 минут, затем центрифугируют 10 минут при 2500-3000 об/мин., надосадочную жидкость отсасывают, а осадок суспендируют в 10 мл физиологического раствора (рН=7,0), получая 10 мл 1% взвеси сенсибилизированных эритроцитов. Такой препарат может сохраняться в течение нескольких дней при +4 град. С без снижения активности. РНГА в этом случае ставят на обычном физиологическом растворе (рН=7,0), в остальном подготовка ингредиентов, постановка реакции и учет результатов проводятся точно также, как при использовании сухого антигенного риккетсиального эритроцитарного диагностикума, за исключением первого разведения исследуемой сыворотки, которое берется не 1:25, а 1:250
2.2. Метод флуоресцирующих антител.
Метод флуоресцирующих антител (МФА) - экспресс-метод - сочетает высокую чувствительность люминесцентного анализа с высокой специфичностью иммунологического метода. МФА применяется в лабораторной диагностике с целью выявления риккетсиальных антигенов и антител. Этот метод используют в прямой и непрямой модификации с применением флуоресцирующих конъюгатов, полученных на основе иммуноглобулинов специфических сывороток.
Ингредиенты и оборудование.
1. Риккетсиальные корпускулярные антигены (для МФА).
2. Специфические антириккетсиальные сыворотки.
3. Люминесцирующие специфические риккетсиальные сыворотки.
4. Люминесцирующие антивидовые сыворотки к иммуноглобулинам человека и различного вида животных.
5. Люминесцирующие Fab-фрагменты риккетсиальных антител.
6. Забуференный физиологический раствор рН = 7,2.
7. Спирт 96 град.
8. Ацетон.
9. Дистиллированная вода.
10. Бычий альбумин, меченый родамином или Эванс.
11. Люминесцентный микроскоп (МЛ-1, МЛ-2, МЛ-Л, ЛЮМАМ).
12. Предметные стекла.
13. Чашки Петри.
14. Емкости для промывания стекол.
15. Фильтровальная бумага.
2.2.1. Прямой метод флуоресцирующих антител.
Прямой метод флуоресцирующих антител (пМФА) используется с целью выявления риккетсиальных антигенов в биологических пробах и объектах внешней среды.
Метод осуществляют следующим образом. На тщательно вымытые и обезжиренные предметные стекла делают тонкие мазки или отпечатки исследуемого материала. После высыхания мазки фиксируют этиловым спиртом или ацетоном в течение 30 минут. По мазку восковым карандашом делают ряд окружностей диаметром 0,5 см, в зависимости от количества искомых антигенов, чтобы создать барьер, препятствующий растеканию люминесцирующей сыворотки.
На эти поля фиксированных и высушенных мазков наносят по капле разведенных флуоресцирующих сывороток против искомых антигенов (рабочее разведение указано на ампуле) в смеси с равным объемом Эванса 0,1% или бычьего альбумина, меченого родамином (в смеси оба раствора должны быть в рабочем разведении). В контрольное поле наносят гетерологичную флуоресцирующую сыворотку так же в смеси с бычьим альбумином. Обработку мазков проводят 30 минут при температуре +37 град. С во влажной камере (чашка Петри с увлажненным дном), что предупреждает высыхание конъюгата. Отмывание мазков от избытка флуоресцирующей сыворотки производят в фосфатном буферном растворе (рН=7,2-7,4) в течение 10 минут. После ополаскивания дистиллированной водой препараты высушивают на воздухе и исследуют в люминесцентном микроскопе.
Учет результатов реакции.
Препараты исследуют в люминесцентном микроскопе, объектив 90х, окуляр 10х или 7х. Первичные светофильтры для МЛ 2-ФС-1-4; СЗС 7-2; БС-8-2, окулярный или запирающий - 2; для ЛЮМАМ - ФС 1-4; СЗС 21-2, ФС 1-6; окуляр зеленый (т.е. фильтры, которые обычно используют для препаратов, обработанных конъюгатом и изотиоцианата флуоресцеина).
Просматривают не менее 10-20 полей зрения. Оценку результатов пМФА проводят на основании количества, яркости флуоресцеина и морфологических особенностей риккетсий. Для этого используют условную систему обозначения при помощи крестов:
"+++++" - яркая, сверкающая флуоресценция;
"+++" - отчетливо выраженная, достаточно яркая флуоресценция с характерным для данного флуорохрома цветов (в данном случае зеленый).
Морфология риккетсий выявляется хорошо, у отдельно лежащих корпускул видны четкие колечки (ободки) за счет более яркого свечения комплекса антител с поверхностным антигеном; "++" - флуоресценция слабая, морфология клеток и цвет люминесценции выявляется достаточно четко; "+" - флуоресценция очень слабая, морфология риккетсий различима плохо, цвет неопределенный; "-" - флуоресценция отсутствует.
Результат считается положительным при обнаружении в некоторых полях зрения не менее 5 риккетсий с интенсивностью свечения возбудителя не менее, чем на "+++" при четко отрицательном контроле.
2.2.2. Непрямой метод флуоресцирующих антител.
Непрямой метод флуоресцирующих антител (нМФА) или реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) используют с целью выявления специфических антител у больных и переболевших риккетсиозами людей и животных.
Метод используют следующим образом. В ампулу с сухим риккетсиальным корпускулярным антигеном за 2 часа до приготовления препарата добавляют 1 мл дистиллированной воды с целью насыщения корпускул риккетсий влагой. Из этого основного разведения готовят рабочее разведение в физиологическом растворе до концентрации, обечпечивающей в каждом поле зрения примерно до 100 риккетсиальных клеток. На предметном стекле, хорошо вымытом и обезжиренном, наносят капли антигена в соответствующем рабочем разведении. На каждое стекло наносят 8 капель. Этого количества достаточно для испытания одной сыворотки. Если в вашем распоряжении имеется взвесь антигена, то с ней поступают следующим образом: из основного раствора готовят рабочее разведение в физиологическом растворе до концентрации, обеспечивающем в каждом поле зрения около 100 риккетсиальных клеток. На предметное стекло, хорошо вымытое и обезжиренное наносят, по 8 капель антигена, тщательно перемешанного пипетированием в соответствующем рабочем разведении кончиком канцелярского пера или туберкулиновым шприцом со срезанным концом.
Мазки хорошо высушивают на воздухе, фиксируют спиртом или ацетоном (приобретенные антигенные пятна уже зафиксированы) в течение 20 минут и сохраняют до использования при температуре от 0 до +4 град. С, в пределах месяца. Препараты необходимо оберегать от увлажнения.
Из испытуемых сывороток, предварительно прогретых в течение 30 минут при +56 град. С, готовят двукратные разведения в физиологическом растворе (от 1:20 до 1:2560, а при необходимости и выше).
Капли из соответствующих разведений сыворотки наносят на мазки антигена и выдерживают 45 минут во влажной камере при +37 град. С. Затем препарат промывают фосфатным буфером (рН=7,2-7,4) в течение 10 минут и высушивают на воздухе.
После высушивания на мазки наносят антивидовой (соответствующий испытуемой сыворотке) люминесцирующий гамма-глобулин в рабочем разведении (это разведение указано на этикетке каждой ампулы); мазки вновь выдерживают во влажной камере 30 минут при +37 град. С. В качестве антивидовых препаратов применяют люминесцирующие сыворотки против гамма-глобулина человека и животных в зависимости от видовой принадлежности испытуемых сывороток. На этом этапе выполнения реакции также рекомендуется использование бычьего альбумина, меченого родамином, или 0,1% раствора Эванса для гашения неспецифического свечения, которые смешиваются с антивидовой люминесцирующей сывороткой в равном объеме, с тем, чтобы иметь рабочие дозы указанных ингредиентов. Далее препараты промывают в двух порциях буфера в течение 10 минут и высушивают на воздухе.
В качестве контроля в каждый опыт вводят заведомо положительную и отрицательную сыворотки и контроль люминесцирующей антивидовой сыворотки: антиген обрабатывают непосредственно антивидовой люминесцирующей сывороткой.
Титром сыворотки считают то наибольшее ее разведение, которое обусловливает свечение риккетсий на "++", при наличии свечения на "+++" или "++++" в предыдущем разведении.
Контроль флуоресцирующей антивидовой сыворотки - свечение риккетсий отсутствует при обработке антигена флуоресцирующей антивидовой сывороткой в рабочем разведении.
2.3. Реакция связывания комплемента.
Реакция связывания комплемента (РСК) является универсальной, так как дает возможность получения объективных результатов при проведении текущей и ретроспективной диагностики. Комплемент связывающие антитела сохраняются в сыворотке переболевших людей десятки лет. В этой связи РСК незаменима для ретроспективной диагностики. РСК имеет целью определение в исследуемых сыворотках специфических антител.
Сущность реакции заключается в связывании комплемента комплексом антиген-антитело, что обнаруживается в присутствии индикатора: бараньих эритроцитов, сенсибилизированных гемолитической сывороткой. При образовании специфического комплекса антиген-антитело последний связывает комплемент, вследствие чего после добавки гемолитической системы не возникает гемолиза бараньих эритроцитов. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, свободный комплемент вызывает гемолиз сенсибилизированных эритроцитов.
Таким образом, положительный результат РСК характеризуется оседанием эритроцитов (задержкой гемолиза), а отрицательный - феноменом гемолиза эритроцитов.
Ниже приведены две схемы постановки РСК, отличающиеся рядом преимуществ в сравнении с ранее применявшимися в нашей стране (Голиневич, 1962):
1) уменьшением объема использованных ингредиентов;
2) упрощением схемы титрования комплемента;
3) получением более достоверных результатов реакции за счет титрования комплемента в присутствии антигенов (риккетсиальные антигены могут поглощать некоторое количество комплемента, что следует принимать во внимание и учитывать при постановке реакции).
Ингредиенты реакции: 1) испытуемая сыворотка, 2) антиген; 3) комплемент, 4) гемолитическая сыворотка, 5) эритроциты барана.
Обязательным условием постановки РСК является использование точно оттитрованных компонентов. Реакцию ставят в объеме 0,5 мл (1-я схема) или 0,6 мл (2-я схема).
Для обеспечения точности получаемых результатов необходимо пользоваться отдельной посудой (пробирки, пипетки, колбы), хорошо вымытой и высушенной в суховоздушном шкафу.
Для каждого ингредиента реакции используют отдельную пипетку. Все разведения делают в свежеприготовленном стерильном физиологическом растворе (0,85% раствор химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде).
Исследуемую сыворотку прогревают перед опытом в течение 30 минут при 56-58 град. С (для разрушения содержащимися в ней комплемента и ингибиторов).
Риккетсиальные антигены растворяют в указанном на этикетке ампулы количестве физиологического раствора, которое соответствует рабочему разведению, определенному предприятием-изготовителем.
Сухой комплемент разводят согласно прилагаемой к этому препарату инструкции. Гемолитическая сыворотка выпускается в ампулах: это - сыворотка кролика, иммунизированного по определенной схеме взвесью бараньих эритроцитов. На этикетке ампулы гемолитической сыворотки указан ее титр. В реакции используют разведение гемолитической сыворотки в три раза меньше титра, указанного на этикетке: например, титр, указанный на этикетке, равен 1:1800; в этом случае в опыт берут сыворотку, разведенную 1:600. При длительном хранении первоначальный титр гемолитической сыворотки может снижаться. Проверку ее титра производят следующим образом. Готовят основное разведение сыворотки 1:100 (0,1 мл гемолитической сыворотки +9,9 мл физиологического раствора). В ряд пробирок последовательно разливают по 0,1 мл разведений гемолитической сыворотки, начиная с 1:1000 до 1:3600, в каждую пробирку добавляют комплемент в разведении 1:10 в объеме 0,1 мл и по 0,1 мл 3% взвеси бараньих эритроцитов; затем доливают в каждую пробирку по 0,2 мл физиологического раствора. Смесь ингредиентов выдерживают в термостате при +30 град. С в течение 1 часа. По наличию полного гемолиза эритроцитов судят о титре сыворотки. Схема титрования гемолитической сыворотки представлена в таблице 1.
Таблица 1
Схема титрования гемолитической сыворотки
-----------------T------------------------------------------------------
¦ Ингредиенты ¦ Разведение гемолитической сыворотки ¦
¦ опыта ¦ ¦
¦ +----------T----------T----------T----------T----------+
¦ ¦ 1:1000 ¦ 1:1200 ¦ 1:1600 ¦ 1:1800 ¦ 1:2000 ¦
+----------------+----------+----------+----------+----------+----------+
¦ Гемолитическая ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ сыворотка (мл) ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦
+----------------+----------+----------+----------+----------+----------+
¦ 3% взвесь ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ бараньих эри- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ троцитов (мл) ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦
+----------------+----------+----------+----------+----------+----------+
¦ Комплемент в ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ разведении ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ (мл) ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦
+----------------+----------+----------+----------+----------+----------+
¦ Физ. ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ раствор (мл) ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦
+----------------+----------+----------+----------+----------+----------+
¦ Оценка ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ результатов ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ опыта ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ ++ ¦
L----------------+----------+----------+----------+----------+-----------
-----------------T------------------------------------------------------
¦ Ингредиенты ¦ Разведение гемолитической сыворотки ¦
¦ опыта +----------T----------T----------T----------T----------+
¦ ¦ 1:2400 ¦ 1:2800 ¦ 1:3000 ¦ 1:3200 ¦ 1:3600 ¦
+----------------+----------+----------+----------+----------+----------+
¦ Гемолитическая ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ сыворотка (мл) ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦
+----------------+----------+----------+----------+----------+----------+
¦ 3% взвесь ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ бараньих эри- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ троцитов (мл) ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦
+----------------+----------+----------+----------+----------+----------+
¦ Комплемент в ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ разведении ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ (мл) ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦
+----------------+----------+----------+----------+----------+----------+
¦ Физ. ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ раствор (мл) ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦
+----------------+----------+----------+----------+----------+----------+
¦ Оценка ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ результатов ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ опыта ¦ ++ ¦ ++ ¦ ++ ¦ ++ ¦ ++ ¦
L----------------+----------+----------+----------+----------+-----------
Титр гемолитической сыворотки 1:1800.
Для получения эритроцитов барана кровь, взятую из яремной вены животного, дефибринируют во флаконе со стеклянными круглыми бусами путем встряхивания в течение 10-15 минут, процеживают через стерильную марлю и хранят в холодильнике при температуре от 0 до +4 град. С. Перед опытом дефибринированную кровь многократно отмывают при центрифугировании физиологическим раствором (до исчезновения следов гемолиза) и готовят взвесь эритроцитов. Эритроциты хранят обычно в течение 1 месяца в консерванте "Консервант крови N 7Б", выпускаемом Пензенским заводом медицинских препаратов, или каком-либо другом консерванте. 1-я схема постановки РСК.
Титрование комплемента. Постановке основного опыта РСК предшествует титрование комплемента с целью определения его рабочей дозы. Титрование комплемента ведут в присутствии антигена. Из основного разведения комплемента 1:10 готовят различные дозы в 1 мл (таблица 2).
Таблица 2
---------------T--------------------------------------------------------
¦Ингредиенты ¦ Дозы комплемента ¦
¦ реакции +-----T-----T-----T-----T------T------T-----T------T-----+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦
+--------------+-----+-----+-----+-----+------+------+-----+------+-----+
¦Комплемент в ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ разведении ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ 1:10 (мл) ¦ 0,1 ¦ 0,2¦ 0,3 ¦ 0,4¦ 0,5¦ 0,6¦ 0,7¦ 0,8 ¦ 0,9 ¦
+--------------+-----+-----+-----+-----+------+------+-----+------+-----+
¦Физиологи- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ческий ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦раствор (мл) ¦ 0,9 ¦ 0,8¦ 0,7 ¦ 0,6¦ 0,5¦ 0,4¦ 0,3¦ 0,2 ¦ 0,1 ¦
L--------------+-----+-----+-----+-----+------+------+-----+------+------
Затем ставят опыт титрования комплемента.
Таблица 3
---------------T--------------------------------------------------------
¦ Ингредиенты ¦ Дозы комплемента ¦
¦ реакции +-----T-----T-----T-----T------T------T-----T------T-----+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦
+--------------+-----+-----+-----+-----+------+------+-----+------+-----+
¦Комплемент в ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ различных ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦дозах (мл) ¦ 0,1 ¦ 0,1¦ 0,1 ¦ 0,1¦ 0,1¦ 0,1¦ 0,1¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦
+--------------+-----+-----+-----+-----+------+------+-----+------+-----+
¦Антиген (мл) ¦ 0,1 ¦ 0,1¦ 0,1 ¦ 0,1¦ 0,1¦ 0,1¦ 0,1¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦
+--------------+-----+-----+-----+-----+------+------+-----+------+-----+
¦Физиологичес- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦кий раствор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ (мл) ¦ 0,1 ¦ 0,1¦ 0,1 ¦ 0,1¦ 0,1¦ 0,1¦ 0,1¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦
+--------------+-----+-----+-----+-----+------+------+-----+------+-----+
¦Гемолитическая¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ система (мл) ¦ 0,2 ¦ 0,2¦ 0,2 ¦ 0,2¦ 0,2¦ 0,2¦ 0,2¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦
+--------------+-----+-----+-----+-----+------+------+-----+------+-----+
¦Оценка резуль-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ татов ¦ 4+ ¦ 3+ ¦ 2+ ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦
L--------------+-----+-----+-----+-----+------+------+-----+------+------
Оттитрованный комплемент ставят в термостат при +37 град. С на 1 час. Через час добавляют гемолитическую систему, состоящую из равных объемов 3% взвеси эритроцитов барана в физиологическом растворе и гемолитической сыворотки в тройном титре (выдержанную предварительно в термостате в течение 30 минут) и через 30 минут производят учет результатов.
Оценка результатов титрования комплемента заключается в определении степени задержки гемолиза: отсутствие гемолиза (полная его задержка) обозначается четырьмя крестами (++++); почти полная задержка (следы гемолиза) обозначается тремя крестами (+++); частичная задержка гемолиза оценивается двумя крестами (++) и, наконец, следы задержки (почти полный гемолиз) - одним крестом (+).
Единицей комплемента считают то наименьшее ее количество, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов. В приведенном примере эта единица соответствует 5-й дозе. За полную единицу комплемента принимают вторую пробирку полного гемолиза, в данном примере - 6-я доза. Рабочая доза комплемента равна одной полной единице комплемента при проведении связывания в термостате при +37 град. С в течение 1 часа.
Постановка основного опыта.
1 этап. Инактивированные испытуемые сыворотки разводят обычно двукратно в пределах 1:10 - 1:640 и выше в зависимости от срока болезни физиологическим раствором и разливают по 0,1 мл. К различным разведениям их добавляют по 0,1 м: антигена и комплемента в рабочих дозах.
К каждому опыту ставят следующие контроли:
1) контроль всех испытуемых сывороток (0,1 мл сыворотки в исходном разведении + 0,1 мл физиологического раствора + 0,1 мл комплемента в рабочей дозе);
2) контроль антигена (0,1 мл антигена + 0,1 мл физиологического раствора, 0,1 мл комплемента в рабочей дозе);
3) контроль комплемента (0,1 мл комплемента в рабочей дозе + 0,2 мл физиологического раствора);
4) контроль гемолитической системы (0,3 мл физиологического раствора);
5) контроль заведомо положительной сыворотки, которую титруют до ее титра;
6) контроль заведомо отрицательной сыворотки, которую титруют в 2-х-3-х разведениях (1:10 - 1:40), включая так, же как и для п. 5 контроль сывороток в исходных разведениях.
После добавления всех указанных ингредиентов и тщательного встряхивания пробирки ставят в термостат при +37 град. С на 1 час.
2 этап. Вынимают пробирки из термостата и добавляют в каждую по 0,2 мл гемолитической системы (предварительно выдержанной в термостате 30 минут). Опять тщательно встряхивают и ставят пробирки в термостат на 20- 30 минут в зависимости от гемолиза эритроцитов в контролях.
2-я схема постановки РСК (по Fiset).
Указанная схема отличается от первой общим объемом реакции - 0,6 мл, упрощенным титрованием комплемента, которое проводится при температуре +4 град. С 16-18 часов не в день постановки реакции, 1-2 раза на протяжении месяца при условии работы с одной серией эритроцитов и комплемента: сухого или нативного, взятого у морских свинок и хранящегося при температуре не выше +/-20 град. С (однако размороженный комплемент повторному замораживанию не подлежит).
Титрование комплемента.
Готовят основное разведение комплемента 1:10 (в случае наличия сухого комплемента содержимое ампулы растворяют в 10 мл физиологического раствора), из которого по схеме получают последующие его разведения (обычно до 1:30 - 1:40) (таблица 4).
Таблица 4
------------------T-----------------------------------------------------
¦ Ингредиенты ¦ Разведения комплемента ¦
¦ +--------T--------T--------T--------T--------T--------+
¦ ¦ 1:15 ¦ 1:18 ¦ 1:20 ¦ 1:25 ¦ 1:30 ¦ и т.д. ¦
+-----------------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+
¦ Комплемент ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ 1:10 (мл) ¦ 1 ¦ 1 ¦ 0,5 ¦ 0,5 ¦ 0,5 ¦ ¦
+-----------------+--------+--------+--------+--------+--------+--------+
¦ Физиологи- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ческий ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ раствор (мл) ¦ 0,5 ¦ 0,8 ¦ 0,5 ¦ 0,75 ¦ 1,0 ¦ ¦
L-----------------+--------+--------+--------+--------+--------+---------
Из приготовленных разведений комплемента переносят по 0,1 мл его в контрольный ряд (без антигена) и опытные ряды (по числу использованных в РСК антигенов) (таблица 5).
Таблица 5
------------------T-----------------------------------------------------
¦ Ингредиенты ¦ Разведение комплемента ¦
+-----------------+-----------------------------------------------------+
¦ Контрольный ряд ¦
¦ (оценка качества комплемента) ¦
+-----------------T------T------T------T------T-------T--------T--------+
¦ ¦ 1:10 ¦ 1:15 ¦ 1:18 ¦ 1:20 ¦ 1:25 ¦ 1:30 ¦ и т.д. ¦
+-----------------+------+------+------+------+-------+--------+--------+
¦Комплемент в ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦различных ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦разведениях (мл) ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1¦ 0,1 ¦ ¦
+-----------------+------+------+------+------+-------+--------+--------+
¦Физиологический ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦раствор (мл) ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2¦ 0,2 ¦ ¦
+-----------------+------+------+------+------+-------+--------+--------+
¦Гемолитическая ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ система (мл) ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2¦ 0,2 ¦ ¦
+-----------------+------+------+------+------+-------+--------+--------+
¦Оценка резуль- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦тата ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ ¦
+-----------------+------+------+------+------+-------+--------+--------+
¦ Опытный ряд ¦
¦ (оценка антикомплементарных свойств антигена) ¦
+-----------------T------T------T------T------T-------T--------T--------+
¦ Комплемент в ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ различных ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ разведениях ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ (мл) ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1¦ 0,1¦ 0,1¦ 0,1 ¦ ¦
+-----------------+------+------+------+------+-------+--------+--------+
¦ Антиген в ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ рабочей дозе ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ (мл) ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1¦ 0,1¦ 0,1¦ 0,1 ¦ ¦
+-----------------+------+------+------+------+-------+--------+--------+
¦ Физиологи- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ческий ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ раствор (мл) ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1¦ 0,1¦ 0,1¦ 0,1 ¦ ¦
+-----------------+------+------+------+------+-------+--------+--------+
¦ Гемолитичес- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ кая система* ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ (мл) ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2¦ 0,2¦ 0,2¦ 0,2 ¦ ¦
+-----------------+------+------+------+------+-------+--------+--------+
¦ Оценка ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ результатов ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ +++ ¦ ¦
L-----------------+------+------+------+------+-------+--------+---------
* Добавляют на второй день титрования комплемента (после 16 - 18 часов экспозиции при температуре +4°С).
Дозу комплемента с антигеном, дающую полный гемолиз, считают за титр комплемента или "полную единицу", в данном примере она соответствует разведению комплемента 1:20. Раз оттитрованной рабочей дозой комплемента можно пользоваться в течение месяца при работе с этой серией комплемента и эритроцитов.
После 30-минутной экспозиции при температуре +37 град. С учитывают результаты.
При постановке реакции "холодным методом" (0 град. С) рабочая доза комплемента соответствует двум полным единицам в виде удвоенного объема комплемента - 0,2 мл. Например, полный гемолиз в опытном ряду, т.е. в присутствии антигена, отмечен в пробирке при разведении комплемента 1:20, а в контрольном ряду - 1:25. В итоге рабочая доза комплемента при использовании в реакции данного антигена соответствует разведению 1:20 в объеме 0,2 мл, поскольку в этих условиях не выявляются антикомплементарные свойства антигена. Например, на 100 пробирок необходимо приготовить 20 мл разведенного 1:20 комплемента (из расчета 0,2 мл на пробирку), следовательно, нужно взять 1,0 мл цельного комплемента и 19,0 мл физиологического раствора.
В случае, если в реакции используют не 1, а 2 или 3 разного вида антигенов, то и титрование комплемента проводят в присутствии всех видов антигенов, после чего выбирают соответствующие дозы комплемента.
При постановке реакции при +37 град. С рабочая доза комплемента составит 1 полную единицу, т.е. объем его не 0,2, а 0,1 мл и общий объем РСК в этом случае будет 0,5 мл.
В основном опыте контролируют рабочую дозу комплемента, полную единицу комплемента и ее половину ("холодное" связывание) или полную единицу комплемента и ее половину (связывание при +37 град. С). Иными словами, в первом случае: 0,2 мл комплемента в рабочей дозе + 0,2 мл физиологического раствора; 0,1 мл комплемента в рабочей дозе + 0,3 мл физиологического раствора, и 0,05 мл комплемента в рабочей дозе + 0,35 мл физиологического раствора. В 1 и 2-ом контролях должен наблюдаться полный гемолиз, в 3-ем - задержка его на три - два креста. Во 2-м случае (т.е. связывание при +37 град. С) для контроля используют 2 последние дозы.
Постановка основного опыта.
Инактивированные испытуемые сыворотки разводят физиологическим раствором и разливают в пробирки (или лунки полистероловых панелей) по 0,1 мл. К различным разведениям исследуемых сывороток добавляют по 0,1 мл антигена и 0,2 мл комплемента в его рабочей дозе.
Каждый опыт должен сопровождаться следующими контролями:
1} контроль всех испытуемых сывороток (0,1 мл сывороток, в исходном разведении + 0,2 мл комплемента в рабочей дозе + 0,1 мл физиологического раствора);
2} контроль антигена (0,1 мл антигена + 0,2 мл комплемента в рабочей дозе + 0,1 мл физиологического раствора);
3} контроль комплемента (как указано выше);
4} контроль гемолитической системы (0,4 мл физиологического раствора).
Кроме того, необходимо в качестве контроля вводить в опыт заведомо положительную и отрицательную сыворотки с их контролями. Положительную сыворотку разводят до ее титра. После тщательного встряхивания пробирки ставят в холодильник при 0 град. С на 16-20 часов (1-й этап реакции, таблица 6).
Таблица 6
Схема постановки основного опыта РСК
-----------T------------------------------------T-----T-----T-----T-----
¦Ингредиен-¦ Разведение сывороток ¦конт-¦конт-¦конт-¦конт-¦
¦ты ¦ ¦роль ¦роль ¦роль ¦роль ¦
¦реакции +----T----T----T----T----T-----T-----+сыв. ¦анти-¦ком- ¦гем. ¦
¦ ¦1:10¦1:20¦1:40¦1:80¦1:60¦1:320¦1:640¦ ¦гена ¦плем.¦сист.¦
+----------+----+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+
¦ 1-й этап ¦
+----------T----T----T----T----T----T-----T-----T-----T-----T-----T-----+
¦Сыворотка ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦(мл) ¦ ¦0,1 ¦ 0,1¦ 0,1¦ 0,1¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ - ¦ - ¦ - ¦
+----------+----+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Антиген ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦(мл) ¦ ¦0,1 ¦ 0,1¦ 0,1¦ 0,1¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ - ¦ 0,1 ¦ - ¦ - ¦
+----------+----+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Компле- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦мент (мл) ¦ ¦0,2 ¦ 0,2¦ 0,2¦ 0,2¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ - ¦
+----------+----+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Физиологи-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ческий ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦раствор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦(мл) ¦ ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ 0,1 ¦ 0,1¦ 0,2 ¦ - ¦
+----------+----+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+
¦ Экспозиция 16 - 20 часов при +4°С ¦
+-----------------------------------------------------------------------+
¦ 2-й этап ¦
+----------T----T----T----T----T----T-----T-----T-----T-----T-----T-----+
¦Гемолити- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ческая ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦система ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦
¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+----------+----+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Физиологи-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ческий ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦раствор ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ 0,4 ¦
¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+----------+----+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+
¦ Экспозиция 20 - 30 минут при +37°С ¦
L------------------------------------------------------------------------
На втором этапе в каждую пробирку или лунку панелей добавляют по 0,2 мл гемолитической системы, предварительно выдержанной в термостате при + 37 град. С 30 минут. Пробирки или панели тщательно встряхивают и ставят в термостат на 20-30 минут в зависимости от гемолиза эритроцитов в контролях. В пробирки с заведомо положительной сывороткой и в контроле гемолитической системы должна наблюдаться задержка гемолиза.
Оценка главного опыта заключается в степени задержки гемолиза в пробирках с испытуемыми сыворотками по сравнению с соответствующими контролями, в которых возник полный гемолиз. Титром сыворотки считают наибольшее ее разведение, характеризующееся задержкой гемолиза не менее чем на три креста.
Результаты реакции считают достоверными, если в контролях испытуемых сывороток, в контроле антигена и рабочей дозе комплемента имеется полный гемолиз, а в контроле гемолитической системы гемолиз отсутствует. Диагностический титр может считаться 1:10 при условии нарастания титра в 4 раза (и более) с интервалом в 7 дней.
В РСК оба ингредиента используются в дозе, равной 1 ЕД. Дозы определяют путем перекрестного ("шахматного") титрования. 2.4. Реакция агглютинации с риккетсиями Провачека (РА).
Реакция агглютинации (РА) является наиболее простым тестом и может быть применена для лабораторной диагностики не только сыпного тифа, но и большинства риккетсиозов. Вместе с тем для ее постановки необходимы дорогостоящие тщательно очищенные корпускулярные риккетсиальные антигены.
Ее преимуществом является минимальное число компонентов реакции (исследуемая сыворотка и антигенный диагностикум) и более раннее выявление агглютининов.
Метод обладает, вместе с тем, существенными недостатками:
1) для исследований пригодны только свежие негемолизированные сыворотки, хранящиеся не более 14 дней;
2) затруднена ретроспективная диагностика, поскольку агглютинины выявляются менее продолжительное время после болезни;
3) в случае использования бесцветного антигена - субъективизм при оценке результатов.