Ферменты - биологические катализаторы белковой природы, ускоряющие химические реакции в живых организмах и вне их. Ферменты обладают уникальными свойствами, которые выделяют их на фоне обычных органических катализаторов гомогенного типа. Прежде всего это необычайно высокая каталитическая активность. Так, добавка незначительной концентрации фермента (10- 9-10- 7 М) ускоряет превращение субстрата в 108-1012 раз. Другое, не менее важное свойство ферментов - специфичность (избирательность) их действия в отношении структуры субстрата, типа реакции и условий ее проведения. Специфичность определяется способностью фермента превращать только данный тип субстратов в определенных реакциях и условиях. Эти свойства ферментов обусловлены сложной структурой макромолекул белка и весьма сложным механизмом их действия.
Превращение субстрата происходит на активном центре фермента. Для многих ферментов, состоящих из субъединиц, характерно наличие регуляторного участка, который взаимодействует с веществами, влияющими на активность фермента, - активаторами, ингибиторами или инактиваторами (рис. 4).
Важным свойством ферментов, которое необходимо учитывать при их практическом использовании, является стабильность, то есть способность сохранять каталитическую активность. При хранении и особенно в ходе ферментативной реакции фермент может частично или полностью терять свою каталитическую активность, другими словами, инактивироваться. Одним из эффективных способов стабилизации ферментов является их иммобилизация - перевод в водонерастворимое состояние путем связывания с носителем или модифицирование водорастворимыми полимерами с полным или частичным сохранением ферментами каталитической активности. Повышение стабильности и возможность многократного использования иммобилизованных ферментов значительно повышают экономичность ферментативных методов анализа.
|
|
2. 1. Возможности ферментативных методов анализа
Пределы обнаружения веществ, определяемых ферментативными методами (субстратов, активаторов, обратимых и необратимых ингибиторов и инактиваторов ферментов) зависят не только от каталитической активности фермента, но и от других кинетических характеристик используемой индикаторной реакции. Фермент катализирует реакции, в которых участвуют, как правило, один или два субстрата. Простейшая односубстратная реакция описывается обычно схемой Михаэлиса-Ментен
E + S ES P + E,
где Е - фермент, S - субстрат, ES - промежуточный комплекс фермента с субстратом (комплекс Михаэлиса-Ментен), Р - продукт. Концентрация субстрата [S]0 будет пропорциональна u0 только при условии, когда [S]0! Km. Тогда
[S]0 = u0Km / kкат[E]
Следовательно, верхняя граница определяемых концентраций субстрата ограничена величиной константы Михаэлиса-Ментен (Km). Нижняя граница определяемых концентраций субстрата определяется той величиной u0, которая может быть зафиксирована с помощью используемого для наблюдения инструментального метода, причем величина u0 тем выше для одного и того же значения [S]0, чем выше kкат и [E]. Таким образом, использование высокоактивного фермента (большое значение kкат) и повышение его концентрации в реакционной смеси могут существенно снизить предел обнаружения субстрата.
|
|
Несколько другие кинетические закономерности следует учитывать при определении тех веществ, которые являются эффекторами ферментов.
Для контроля начальной скорости ферментативного процесса или концентрации продукта реакции могут быть использованы практически любые доступные исследователю физико-химические методы. Наиболее часто применяют фотометрические методы индикации. При этом в качестве индикаторных часто используют, например, катализируемые пероксидазой и другими оксидазами (ферментами, катализирующими окислительно-восстановительные реакции), а также гидролазами (катализирующими реакции гидролиза) реакции образования окрашенных продуктов. Исключительно высокой чувствительностью отличаются хемилюминесцентные методы, позволяющие контролировать скорость ферментативных реакций с участием, например, люциферазы. Различные электрохимические методы (потенциометрия, амперометрия) наиболее удобны для контроля скорости реакций, протекающих с поглощением или выделением протонов, а также окислительно-восстановительных процессов, сопровождающихся поглощением кислорода, образованием Н 
О и т.д. Ферментные электроды, в которых фермент механически или ковалентно включают в полупроницаемую полимерную мембрану, покрывающую электрод, позволяют специфически определять различные органические и неорганические соединения без введения в анализируемый раствор дополнительных реагентов.
К настоящему времени разработано большое число высокочувствительных и селективных ферментативных методов определения субстратов и эффекторов ферментов: неорганических (ионов металлов, анионов) и органических (N-, S-, P-, O-содержащих) соединений. При этом можно выделить ферменты, позволяющие определять целый класс соединений, либо часть этого класса, либо индивидуальное соединение. Так, с помощью алкогольдегидрогеназы можно определять спирты (субстраты этого фермента), алкогольоксидазы - первичные спирты, арилалкогольоксидазы - ароматические первичные спирты. Следует отметить, что методы определения эффекторов, хотя и менее селективны, часто более чувствительны, чем методы определения субстратов. Так, пределы обнаружения многих органических веществ - субстратов ферментов лежат в интервале 10- 6-10- 4 М, а органических эффекторов - 10-11-10- 8 М. Кроме того, число эффекторов ферментов значительно больше, чем число их субстратов, что расширяет возможности ферментативных методов анализа.
|
|
2. 2. Определение органических соединений
Ферментативные методы определения органических соединений успешно разрабатываются и применяются в клинических и биохимических лабораториях. Именно применение ферментов дает возможность селективно определять в крови, моче, тканях и других биологических объектах малые количества таких метаболитов и физиологически активных веществ, как мочевина, мочевая кислота, аминокислоты, сахара (в частности, глюкоза), спирты, липиды, холестерин, нуклеотиды, антибиотики.
Ферментативное определение мочевины основано на реакции ее гидролиза, катализируемой ферментом уреазой. Образующиеся продукты гидролиза - ионы и можно определять электрохимически, фотометрически или флуориметрически. Групповое определение аминокислот основано на использовании таких ферментов, как L-амино- или D-аминооксидаза, которые катализируют окисление аминокислоты кислородом воздуха до кетокислоты, пероксида водорода и аммиака. Последний далее определяют электрохимически с помощью NH3-чувствительного газового электрода. Специфическое определение отдельных аминокислот возможно при применении декарбоксилаз, дегидрогеназ, лиаз, трансфераз. Для определения глюкозы используют несколько специфических ферментативных реакций, например: 1) катализируемое глюкозооксидазой окисление ее кислородом воздуха (или другими окислителями) до глюконовой кислоты и пероксида водорода; 2) ее взаимодействие с АТФ с образованием глюкозо-6-фосфата в присутствии гексокиназы. При использовании первой реакции определение глюкозы проводят либо наблюдая за уменьшением количества кислорода в растворе с помощью О2-чувствительного электрода Кларка, либо измеряя рН раствора, который изменяется вследствие образования глюконовой кислоты, либо определяя количество образовавшегося пероксида водорода. Ферментативные методы определения сахарозы и других дисахаридов основаны на использовании специфических ферментов (инвертазы, лактазы), превращающих дисахариды в моносахариды, одним из которых является глюкоза. Далее глюкозу определяют с помощью описанного выше метода. Ферментативное определение этанола основано на использовании одного из двух ферментов: алкогольоксидазы, катализирующей окисление этанола кислородом воздуха до ацетальдегида и Н2О2, или алкогольдегидрогеназы, в присутствии которой спирт в реакции с НАД (никотинамидадениндинуклеотидом) превращается в НАД " Н2.
Определение различных токсичных соединений, таких, как фенолы, ароматические амины, фосфор-, сероорганические соединения, является важной задачей аналитической химии и в первую очередь связано с проблемами контроля и охраны окружающей среды.
Некоторые токсичные соединения являются субстратами специфических ферментов, что позволяет значительно упростить подготовку проб сложных по составу объектов анализа. Например, определять мочевину в воде плавательных бассейнов, почве позволяет использование уреазы, для которой мочевина является высокоспецифическим субстратом.
Однако в большинстве предложенных методов для определения токсичных соединений используют их ингибирующее действие на ферменты. Например, фосфорсодержащие пестициды определяют по ингибированию холинэстеразы или карбоксилэстеразы; серосодержащие ингибиторы, различные фенолы - с помощью пероксидазы; по ингибированию свечения бактериальной люциферазы определяют инсектициды: ДДТ, пентахлорфенол. Для определения фунгицидов и инсектицидов в плодах, ягодах, листьях применяют папаин, ацетилхолинэстеразу.
2. 3. Определение неорганических соединений
Ферментативные методы успешно применяют для чувствительного и селективного определения ионов металлов, неорганических анионов, пероксида водорода, кислорода, растворенного в воде. Многие ионы металлов (например, Ag, Cu, Hg, Zn, Bi, Cd) можно определять с применением ферментов в количествах, недоступных определению с помощью большинства физико-химических методов анализа. Так, с применением щелочной фосфатазы разработан метод определения нанограммовых количеств бериллия. По ингибирующему действию на алкогольдегидрогеназу возможно определять ионы серебра в концентрации 10 пг/мл. Предложенные методы определения ртути по ингибирующему действию на пероксидазу и уреазу являются одними из самых чувствительных методов. Важно отметить, что приведенные методы являются не только высокочувствительными, но и селективными. Обычно же методы, основанные на ингибирующем или активирующем действии ионов металлов на фермент, не отличаются высокой селективностью. Однако избирательность методов можно повысить при использовании обычных для аналитической химии приемов маскирования.
Наиболее чувствительными и селективными являются ферментативные методы определения ионов металлов по реактивации апофермента (белковой части фермента). Так, для определения цинка и кальция использована реактивация апофермента, полученного удалением ионов цинка из щелочной фосфатазы. Чувствительный и селективный метод определения меди основан на реактивации апофермента, полученного диализом иммобилизованной полифенолоксидазы.
Для определения анионов, таких, как CN-, чаще всего используют ферментные электроды, позволяющие проводить экспрессный анализ сложных промышленных и биологических объектов. Как правило, в ферментных электродах применяют иммобилизованные ферменты. Чаще всего анионы являются субстратами в тех ферментативных реакциях, которые положены в основу методов их определения. Пределы обнаружения анионов при использовании ферментных электродов обычно выше 10 мкМ. Следует особо выделить высокочувствительные методы определения таких физиологически активных анионов, как CN-, I-, S2 -, F -, основанные на их реактивирующем действии на инвертазу, ингибированную ртутью или серебром (с пределами обнаружения 0,2-10 нг/мл), а также на ингибирующем действии на пероксидазу и кислую фосфатазу.
Определение других неорганических соединений - аммиака, кислорода, диоксида серы, пероксида водорода основано на том, что они являются субстратами многих ферментов и, следовательно, могут быть определены с их помощью.
Расширению применения ферментов в аналитической химии способствуют дальнейшее развитие энзимологии, разработка новых способов стабилизации ферментов, выделение и исследование новых ферментов.