Тема 1.
Организация работы в гематологическом отделе клинико-диагностической лаборатории.
1. Правила взятия биологического материала для гематологических исследований.
Взятие крови.
Правильное взятие крови требует выполнения нескольких условий:
- необходимо работать в перчатках и соблюдать все правила профилактики СПИД и гепатитов;
- все материалы для взятия крови должны быть стерильными;
- пациент не должен принимать пищу последние 12 часов;
- взятие крови производят утром, в 8-9 часов;
- тщательно обработать место взятия крови 70% этанолом.
Чаще всего для получения крови для клинических лабораторных исследований используются:
§ венепункция;
§ взятие капиллярной крови.
Венозная кровь является лучшим материалом не только для определения биохимических, гормональных, серологических, иммунологических показателей, но и для гематологических исследований. Это обусловлено тем, что применяемые в настоящее время гематологические анализаторы, с помощью которых проводят клинические исследования крови, предназначены для работы с венозной кровью. Выпускаемые фирмами калибровочные и контрольные материалы предназначены для калибровки гематологических анализаторов по венозной крови.
Взятие и обработка крови
Исследование рекомендуется проводить утром натощак или через 1 час после легкого завтрака. Кровь для проведения общего клинического анализа берут у пациента из пальца, вены или из мочки уха, а у новорожденных — из пятки. Не рекомендуется брать кровь после физической и умственной нагрузки, применения медикаментов, особенно при внутривенном или внутримышечном их введении, воздействия рентгеновских лучей и после физиотерапевтических процедур. В экстренных случаях этими правилами пренебрегают.
· Реактивы:
5%-ный раствор трехзамещенного цитрата натрия, хранят 1–2 недели, при помутнении негоден.
Трансформирующий раствор.
· Изотонический раствор (0,9%) натрия хлорида.
· 3–5%-ный раствор уксусной кислоты.
· Спирт.
· Оборудование:
Стерильные скарификаторы.
· Пробирки.
Мерные пипетки объемом 20 мкл.
· Капилляры от аппарата Панченкова.
· Дозаторы или мерные пипетки объемом 1 мл и 5 мл.
· Предметные стекла.
· Шлифовальные стекла для приготовления мазков крови.
Взятие капиллярной крови. Капиллярную кровь получают с помощью прокола: 1 - мякоти концевых фаланг пальцев рук, 2- мочки уха, 3 - у новорожденных — пятки или большого пальца ноги. Прокол должен быть глубокий, около 3-4 мм. Не следует брать кровь из воспаленных или поврежденных участков. Если место предполагаемого прокола холодное или цианотическое, его предварительно согревают массированием или погружением конечности в теплую воду. Кожу обрабатывают семидесятипроцентнымэтиловым спиртом и затем прокалывают. Первую каплю снимают ватным тампоном. Из следующих капель крови при легком надавливании быстро набирают необходимое количество крови. Кровь с поверхности пальца набирается индивидуальным стерильным капилляром Панченкова.
Заранее наливают в пробирки соответствующие реактивы: для определения СОЭ — в капилляр Панченкова набирают 25 мкл (до метки 75) реактива 1; для определения концентрации гемоглобина — 5 мл реактива 2; для подсчета числа эритроцитов — 4 мл реактива 3; для подсчета числа лейкоцитов — 0,4 мл реактива 4.
Обработка крови. Обработку крови начинают с разведения для определения СОЭ, так как для этого исследования требуется наибольшее количество крови. Для определения СОЭ в капилляр, промытый в реактиве 1, набирают кровь до метки 0 (100 делений) и выдувают ее в пробирку с раствором цитрата натрия (соотношение при этом крови и реактива 4:1). Затем разводят кровь для подсчета количества эритроцитов. Для подсчета количества эритроцитов кровь объемом 20 мкл выдувают на дно пробирки с реактивом 3 и промывают пипетку несколько раз в верхнем слое жидкости (разведение 1:200). Для определения концентрации гемоглобина 20 мкл крови выдувают на дно пробирки с реактивом 2 и промывают капилляр сали несколько раз в верхнем слое жидкости (разведение 1:251). Для подсчета количества лейкоцитов кровь объемом 20 мкл выдувают на дно пробирки с реактивом 4 и промывают капилляр несколько раз в верхнем слое жидкости (разведение 1:20). Для исследования лейкоцитарной формулы, морфологии эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов готовят препараты. Наносят каплю крови на сухое обезжиренное предметное стекло и быстро готовят тонкие мазки с помощью шлифовального стекла.
В настоящее время в связи с появлением гематологических анализаторов стали шире использовать для общего клинического анализа венозную кровь, которую берут либо в специальные пластиковые пробирки одноразового использования с порошком ЭДТА, либо в стеклянные пробирки с другим антикоагулянтом. Сразу после взятия крови пробирку закрывают пробкой и несколько раз тщательно перемешивают кровь, не взбалтывая, что позволяет избежать образования сгустков, наличия которых искажает результаты.
2. Общие требования к гематологическому мазку. Правила приготовления, фиксации и окраски мазков для исследования морфологии эритроцитов, автоматические методы окраски.
Исследование морфологии эритроцитов. В клинической практике морфологию эритроцитов обычно исследуют в окрашенных мазках крови. Унифицированная методика приготовления мазков крови.
Подготовка стекол.Реактивы: Хозяйственное мыло — 2%-ный раствор или раствор стирального порошка: 20 г растворить в 975 мл воды и добавить 20 мл пергидроля. Смесь Никифорова: равные части этилового спирта 96°-го и диэтилового эфира.
Ход обработки стекол. Стекла (новые и бывшие в употреблении) помещают в эмалированную посуду с реактивом 1 на 8–10 час. Кипятят в указанном растворе 10–15 мин., старые мазки предварительно стирают ветошью или ватным тампоном. Более длительное кипячение или использование алюминиевой посуды не рекомендуют, так как стекла мутнеют. Промывают в проточной воде, вытирают и помещают в смесь Никифорова на 60 мин., затем вытирают насухо. Чистые стекла рекомендуется брать либо пинцетом, либо за края (соприкосновение пальцев с поверхностью стекла оставляет жирные следы). Для стерилизации упаковывают по 2 стекла в индивидуальный набор на каждого больного. Стерилизуют сухим жаром в течение 1 час при 180°С.
Техника приготовления мазков. На сухое, подготовленное описанным выше способом предметное стекло наносят мазок крови следующим образом. На стекло ближе к короткой стороне, отступая 1,5 см от края, наносят стеклянной палочкой (или непосредственно из места укола) небольшую каплю крови. Оставляют стекло в горизонтальном положении и размазывают каплю крови по стеклу с помощью чистого шлифованного стекла, помещая его под уголом 45° коротким ребром; подождав, пока вся кровь расплывется по нему, быстро проводят по предметному стеклу. Не следует сильно нажимать на стекло, так как при этом сильно травмируются форменные элементы крови. Мазки высушивают на воздухе и маркируют (лучше простым карандашом). Высохший мазок должен быть равномерно тонким, желтоватого цвета, достаточной величины (располагаться на 1,0–1,5 см от краев, занимать почти всю длину стекла) и оканчиваться «метелочкой». Толстые (густо-розового цвета) мазки не следует использовать, так как в них морфология клеток плохо различима. Стандартные качественные мазки получаются при использовании автоматических устройств, предназначенных для приготовления мазков, выпускаемых различными фирмами.
Фиксация и окраска мазков. Реактивы для фиксации: метиловый спирт х.ч. или раствор эозинметиленового синего по Маю-Грюнвальду. Фиксация предотвращает попадание воды в клетки и изменение их морфологии. Фиксация мазков. Фиксатор мазков наливают либо в кювету, либо в широкогорлую посуду с притертой пробкой. Высушенные на воздухе мазки помещают в контейнер, который опускают в кювету с фиксатором (или кладут по одному в посуду) на 5–10 минут. Вынимают контейнер со стеклами из кюветы (или вынимают пинцетом стекла и устанавливают в штативе), оставляют на воздухе до полного высыхания.
Реактивы для окраски мазков по Нохту. Основной раствор азура II: 1 г краски растворяют в 1 мл дистиллированнной воды. Оставляют на 12–14 дней в посуде из темного стекла при комнатной температуре, после чего используют.
Основной раствор эозина калия: 1 г краски растворяют в 1 л дистиллированной воды. Оставляют в посуде из темного стекла при комнатной температуре на 12–14 дней, затем используют.
Фосфатный буфер (смесь Вейзе)с pH 7,4–7,5: смешивают 0,49 г калия фосфата однозамещенного безводного (KH2PO4) и 0,909 г натрия фосфата двузамещенного безводного (Na2HPO4) и дистиллированной воды 1 л.
Рабочий раствор азур-эозина: перед употреблением смешивают 25 мл основного раствора азура II, 20 мл основного раствора (пропорции красителей могут варьировать, их устанавливают опытным путем при приготовлении свежих партий основных растворов).
Реактивы для окраски мазков по Паппенгейму. Раствор эозин-метиленового синего по Маю-Грюнвальду. При отсутствии готового раствора красителя его можно приготовить, растворив 1 г сухого красителя в 1 л метилового спирта. Раствор готов к употреблению через 4 дня.
Рабочий раствор азур-эозина по Нохту.
Реактивы для окраски мазков по Романовскому-Гимзе. Краска Романовского-Гимзы заводского приготовления имеет следующий состав: азур II — 3 г; водорастворимый эозин — 0,8 г; метиловый спирт — 250 мл; глицерин — 250 мл.
Краска Романовского-Гимзы сухая: 3,8 г сухой краски растворяют в 250 мл метилового спирта (или этилового), оставляют на 3 дня. Затем добавляют 250 мл глицерина и снова оставляют на 3–5 суток, периодически взбалтывая. Краску фильтруют. Хранится в темной посуде. Готовый раствор Романовского-Гимзы перед употреблением разводят из расчета: 1 капля краски на 1 мл нейтральной дистиллированной воды или буферного раствора.
Специальное оборудование. Кювета для фиксации и окрашивания мазков со штативом-контейнером (при отсутствии используют эмалированные мойки с установленными для стекол «рельсами» из пары стеклянных палочек, соединенных резиновыми трубками).
Окраска по Нохту. Высохшие фиксированные мазки, не вынимая из контейнера, помещают в кювету с рабочим раствором краски на строго определенное время, подобранное для каждой партии красителя (от 30 до 45 мин.). При отсутствии кюветы с контейнером стекла помещают горизонтально на «рельсы» (мазком кверху) и наливают высокий слой (3–4 мл на мазок) рабочего раствора краски. Вынимают контейнер со стеклами из кюветы с красителем и помещают его в кювету с водопроводной водой. Высушивают мазки на воздухе.
Окраска по Паппенгейму. Сухие нефиксированные мазки помещают в кювету с раствором Мая-Грюнвальда на 3–5 минут (или наливают на мазок, помещенный на «рельсы», раствор высоким слоем). Контейнер с мазками ополаскивают в кювете с дистиллированной водой (или на мазок, помещенный на «рельсы», не смывая краситель, добавляют дистиллированную воду на 1 мин.). Помещают контейнер с мазками в кювету с азур-эозиновой краской по Нохту (или наливают на мазок краску) на 8–15 минут. Смывают краску водопроводной водой. Мазки высушивают на воздухе.
Окраска по Романовскому-Гимзе производится так же, как и по Нохту: в качестве красителя используют готовый раствор Романовского-Гимзы. Время окраски устанавливают опытным путем для каждой новой партии красителя (25–40 минут).
Автоматическая фиксация и окраска мазков может быть осуществлена с помощью специальных устройств, в которые ручным способом загружают нефиксированные мазки. Последующее автоматическое дозирование фиксатора-красителя и буферных растворов обеспечивает стандартную и равномерную окраску мазков.
Анализ морфологии эритроцитов. Принцип. Исследование окрашенных мазков крови с помощью иммерсионной системы микроскопа.