Определение индекса токсичности

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

Определение токсичности воды устройством БИОТОКС

Принцип методики

Методика основана на определении изменения интенсивности биолюминесценции генно-инженерных бактерий при воздействии токсических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем. Люминесцентные бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за генерацию биоповреждений (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат), с экспрессностью, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие токсикантов. Это обеспечивается тем, что люминесцентные бактерии содержат фермент люциферазу, осуществляющую эффективную трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для экспрессных и количественных измерений.

Критерием токсического действия является изменение интенсивности биолюминесценции тест-объекта в исследуемой пробе по сравнению с таковой для пробы с раствором, не содержащим токсических веществ. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.

Острое токсическое действие исследуемой воды на бактерии определяется по ингибированию их биолюминесценции за 30-минутный (в экспрессном варианте - 5 минут) период экспозиции. Количественная оценка параметра тест-реакции выражается в виде безразмерной величины - индекса токсичности "Т", равной отношению:

Т = 100 (Io - I) / Io,

где Io и I - соответственно интенсивность свечения контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемого раствора с тест-объектом.

Методика допускает три пороговых уровня индекса токсичности:

1) допустимая степень токсичности: индекс токсичности Т меньше 20;

2) образец токсичен: индекс Т равен или больше 20 и меньше 50;

3) образец сильнотоксичен: индекс токсичности Т равен или более 50.

Определение индекса токсичности

При определении индекса токсичности необходимо проводить параллельное измерение контрольных (не содержащих токсических веществ) и опытных проб. Рекомендуется иметь не менее трех повторностей опытной пробы. Для большей достоверности данных число повторностей опытной пробы может быть увеличено до 10 измерений. Существует два варианта измерений. Первый вариант - измеряется контрольная проба и запоминается значение интенсивности свечения. Затем измеряются повторности опытной пробы и прибор автоматически фиксирует значения индекса токсичности каждой пробы, усредненное значение индекса токсичности и погрешности измерения. Второй вариант - измеряются последовательно три (или более) пары контроль - опыт. В каждой паре прибор автоматически фиксирует индекс токсичности и в конце измерения выдает значения усредненного индекса токсичности пробы и значения погрешности измерения. Объем добавляемой суспензии бактерий к пробе может быть произвольным, но равным в контроле и исследуемой пробе.

При стандартном анализе отбирают из флакона по 0,1 мл рабочей суспензии бактерий и добавляют в три кюветы от люминометра контрольные и три (или более - до 10) кюветы для пробы. Добавляют в контрольные кюветы по 0,9 мл дистиллированной воды (рН 7,0 - 7,4). Добавляют в остальные кюветы по 0,9 мл опытной пробы, замечают время экспозиции и через определенный интервал измеряют интенсивность биолюминесценции бактерий.

Измерение интенсивности биолюминесценции и индекса токсичности проводят с помощью прибора "Биотокс" согласно инструкции по эксплуатации прибора в стандартном варианте через 30 минут экспозиции. В экспрессном варианте допустимо проведение анализа через 5 минут.

ценку токсичности пробы проводят по относительному различию в интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб и вычислению индекса токсичности "Т" (прибор "Биотокс" позволяет автоматически вычислять индекс токсичности). Абсолютная величина интенсивности биолюминесценции контроля не имеет принципиального значения в диапазоне допустимых значений прибора "Биотокс".

Индекс токсичности "Т" есть величина безразмерная и определяется по формуле: Т = 100 (Io - I) / Io, где Io и I - соответственно интенсивность свечения контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемого раствора с тест-объектом. Обработку результатов измерений токсичности выполняют путем расчета среднеарифметического значения величины индекса токсичности "Т" по формуле: Т = (Т1 + Т2 + Т3) / 3, где Т1 - Т3 - повторности (до 10) опытной пробы. Величины Т1, Т2 и Т3 получают из трех параллельных измерений контроль - опыт в короткий промежуток времени или при измерении в последовательности контроль и затем - серия опытных образцов.

В случае определения токсичности пробы (Т равно или больше 20) можно определить, насколько это связано со значениями рН исследуемого раствора. Для этого измеряют рН пробы и, если величина рН находится за пределами 6,5 - 8,0, приводят рН до значений 7,0 - 7,4 и повторяют измерение токсичности.

В ряде случаев возможен вариант, когда интенсивность биолюминесценции в анализируемой пробе больше, чем в контроле. В таком случае, независимо от величины отрицательного значения "Т", делается вывод об отсутствии токсичности образца и индекс токсичности принимает нулевое значение.

По величине индекса токсичности анализируемые пробы классифицируются на три группы

Прибор серии "Биотокс-10" обеспечивает в автоматическом режиме вычисление усредненного значения индекса токсичности, погрешности измерения индекса токсичности и гамма-функции исследуемой пробы (токсикологических характеристик - ЕС20 и ЕС50).

Результат токсикологического анализа представляется в виде протокола (Приложение 1).

Приложение 1