Относительным противопоказанием является кровотечение, в том числе менструальное.

Федеральное государственное учреждение

«Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии

Им. академика В.И.Кулакова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Г. Москва, ул. Академика Опарина, дом 4.

 

«Интегральная оценка состояния микробиоты влагалища. Диагностика оппортунистических вагинитов»

(Медицинская технология)

Москва

Аннотация

Представленная технология впервые предлагается для использования на территории России. Технология позволяет дать интегральную оценку состояния микроценоза (микробиоты) влагалища и выявить оппортунистические инфекции влагалища на основании микроскопии грам-мазков и культурального исследования отделяемого влагалища. Сочетание обоих методов позволяет с наименьшими экономическими затратами получить достоверную информацию о состоянии микрофлоры влагалища, диагностировать инфекции, вызванные условно-патогенными микроорганизмами (УПМ) и предложить наиболее рациональные схемы этиотропного лечения в каждом конкретном случае. Это позволяет избежать осложнений, связанных с неадекватной стартовой антибиотикотерапией, а также предупредить развитие осложнений беременности (самопроизвольные выкидыши, преждевременные роды), и после инвазивных процедур, в том числе хирургических вмешательств.

Медицинская технология предназначена для врачей бактериологов, акушеров-гинекологов.

Масштаб использования: перинатальные центры, научно-исследовательские институты, клинико-диагностические центры, микробиологические лаборатории многопрофильных больниц.

 

Авторы: д.м.н. профессор Анкирская А.С.; к.б.н. Муравьёва В.В.

Рецензенты:

В.Е.Радзинский – заведующий кафедрой акушерства и гинекологии с курсом перинатологии ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук профессор;

Л.В.Пожалостина. – руководитель лаборатории микробиологии и профилактики кишечных инфекций ФГУН «Московский научно-исследовательский институт микробиологии и эпидемиологии им. Г.Н.Габричевского» Роспотребнадзора, кандидат медицинских наук;

О.Г. Ефимова – руководитель лаборатории клинической микробиологии ФГНУ «Московский научно-исследовательский институт микробиологии и эпидемиологии им. Г.Н.Габричевского» Роспотребнадзора, кандидат биологических наук.

 

Организация – разработчик/ заявитель ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И.Кулакова» Министерства здравохранения и социального развития Российской Федерации.

 

 

Разделы описания новой технологии

1. Введение

2. Показания к использованию новой медицинской технологии

3. Противопоказания к использованию

4. Материально-техническое обеспечение медицинской технологии

5. Описание новой медицинской технологии

6. Возможные осложнения и способы их устранения

7. Эффективность использования новой медицинской технологии

8. Список литературы

 

 

Введение

 

 

Инфекции влагалища - самая распространенная патология в акушерско-гинекологической практике. Несмотря на очевидный прогресс в антибактериальной терапии, снизить заболеваемость этими инфекциями не удается. Скорее наоборот, неспецифические вагиниты становятся всё более серьёзной проблемой с точки зрения не только их частоты и невозможности предотвратить рецидивы, но и все более очевидного влияния вагинальных инфекций на функциональное состояние репродуктивной системы в целом.

Сформировалось представление о многокомпонентности микробиоты влагалища, причём не только по видовому составу, но и по количественной характеристике каждого из ассоциантов [4]. Одни и те же УПМ могут быть в одних условиях возбудителями «неспецифических» (оппортунистических) вагинитов, а в других – составной частью нормальной микрофлоры. Именно нарушения количественных соотношений в бактериальном сообществе влагалища приводят к развитию клинических проявлений вагинита. Установлена отчётливая связь бактериального вагиноза (БВ) и других оппортунистических вагинитов с неблагоприятным исходом беременности: преждевременные роды и преждевременное излитие околоплодных вод в 3 – 4 раза чаще встречаются у женщин с БВ, чем при нормальном составе микроценоза влагалища. Частота послеродового эндометрита увеличивается в 3 – 7 раз у родильниц с БВ [1].

Из-за общности антигенов УПМ и тканевых антигенов организма-хозяина длительная персистенция УПМ в очаге хронической урогенитальной инфекции может инициироваться аутоиммунный процесс и развитие аутоиммунного заболевания. Самого пристального внимания заслуживают сообщения об эпидемиологической связи БВ с неопластическими процессами шейки матки [1].

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о необходимости своевременной диагностики инфекций влагалища, чтобы объективно оценить риск их влияния на развитие акушерской и гинекологической патологии.

Трудность диагностики оппортунистических инфекций влагалища заключается в том, что само по себе выделение микроорганизмов из патологического материала и тем более их индикация (например, с помощью ПЦР-диагностики) не являются доказательством их этиологической роли, так как те же самые микроорганизмы колонизируют влагалище в норме.

До настоящего времени при лабораторной диагностике вагинальных инфекций проводят или только микроскопию вагинальных мазков или только культуральное исследование. При этом каждое исследование проводят в разных лабораториях – микроскопию вагинальных мазков в клинико-диагностических лабораториях, а культуральное исследование – в микробиологических лабораториях.

При рутинном культуральном исследовании учитывают только аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы, что не дает представления о строго анаэробном компоненте микроценоза, а также не позволяет выявлять лактобациллы - компонент нормоценоза.

В зарубежной практике для диагностики вагинальных инфекций используют микроскопию нативных (неокрашенных) вагинальных мазков [4,5], которую проводит врач акушер-гинеколог на амбулаторном приеме. Такая практика не принята в России. В нашей стране микроскопию окрашенных метиленовым синим влагалищных мазков проводят в клинико-диагностических лабораториях. Такая микроскопия нативных или окрашенных синькой мазков позволяет выявлять лишь частичный круг возбудителей (грибы при высоком их титре, трихомонады и диагностировать бактериальный вагиноз в его классическом варианте). При этом невозможно оценить морфологические типы бактерий, их тинкториальные свойства (отношение к окраске по Граму), что принципиально важно при оценке состояния микробиоты – норма или патология. Кроме того, выпадает из поля зрения большая группа оппортунистических вагинитов, вызванных факультативно анаэробным бактериями, которые могут быть диагностированы только при культуральной диагностике.

С другой стороны, полноценное культуральное исследование, включающее все необходимые группы микроорганизмов (в том числе облигатно анаэробные бактерии), очень продолжительно по времени, трудозатратно, требует высокой квалификации специалистов. Поэтому не может удовлетворить клиническую практику, даже только с точки зрения продолжительности исследования. Характеристика резидентного компонента микрофлоры влагалища (лактобацилл) также не входит в рутинное бактериологическое исследование.

Предлагаемая технология, объединяя оба метода с определенными модификациями, позволяет получить в короткие сроки (2-3 дня) результат, который дает врачу-клиницисту исчерпывающую информацию о состоянии микробиоты влагалища и чувствительности выделенных возбудителей к антибиотикам. Это позволяет выбрать адекватное этиотропное лечение, предусмотреть возможные осложнения, связанные с селективным действием антимикробных препаратов, а также решать вопрос о целесообразности применения биопрепаратов после окончания антибиотикотерапии.

Эффективность объединения двух методов основана на том, что при микроскопии мазков разрешающая способность оптики позволяет выявлять микробные клетки, когда их количество в патологическом материале превышает уровень 5 lg КОЕ/мл. Поэтому БВ, при котором облигатно анаэробные бактерии достигают уровня 9-12 lg КОЕ/мл, может быть диагностирован уже при микроскопии отделяемого влагалища, так как в норме содержание бактерий этой группы не превышает 3-4 lg КОЕ/мл, и при микроскопии они не выявляются. Поэтому для диагностики БВ отпадает необходимость проведения культурального исследования. Это исследование не является необходимым ещё и потому, что в настоящее время имеются два антибиотика с антианаэробной активностью (метронидазол и клиндамицин), к которым строго анаэробные бактерии сохраняют высокую чувствительность, и поэтому нет необходимости определять чувствительность лабораторным методом.

Что касается бактерий факультативно-анаэробной группы, то диагностическая ценность микроскопии значительно снижается. Патогенные потенции этих бактерий гораздо выше, чем у строго анаэробных бактерий, и они могут проявляться при сравнительно небольшом количестве (4 - 5 lg КОЕ/мл), которое находится на грани выявления при микроскопии. Кроме того, даже если морфотипы факультативно-анаэробных бактерий и выявляются в грам-мазках (чаще это единичные микробные клетки в поле зрения), то они одинаковы у многих видов и родов бактерий (колиформные палочки или грамположительные кокки). В то же время их патогенные свойства и спектр чувствительности к антибиотикам весьма разнообразны. Игнорирование этих особенностей может стать причиной не эффективности лечения. Поэтому для характеристики факультативно-анаэробной части микробиоты влагалища, а также лактобацилл, которые по морфологии бывают сходными со многими видами грамположительных облигатно анаэробных бактерий (клостридии, эубактерии, пропионибактерии и другие) необходим посев вагинального отделяемого с количественной оценкой роста, выделением чистых культур, оценкой их этиологической роли и определением чувствительности к антибиотикам этиологически значимых микроорганизмов.

 

2. Показания к использованию новой медицинской технологии:

 

- Диагностика инфекционно-воспалительных заболеваний влагалища;

- Профилактика восходящего инфицирования плода

- Профилактика преждевременного прерывания беременности в группах риска по инфекционной патологии;

- Подготовка к программе ЭКО;

- Профилактика инфекционных осложнений перед оперативными вмешательствами и инвазивными процедурами на органах репродуктивной системы.

 

3. Противопоказания к использованию:

Относительным противопоказанием является кровотечение, в том числе менструальное.

Снижать точность и чувствительность МТ может несоблюдение правил взятия материала для микробиологического исследования, в частности, обследование на фоне антимикробной терапии или в ближайшие 3-5 дней после её окончания.

 

 

4. Материально-техническое обеспечение МТ

Для осуществления новой медицинской технологии используются средства и расходные материалы, разрешенные к применению в медицинской практике на территории РФ и обычно используемые в рутинной лабораторной практике:

1. Набор реагентов для окраски по Граму (генциан-виолет, этиловый спирт 96 %, раствор Люголя, эозин); по ТУ 9389-083-70423725-2007, производства ЗАО «ЭКОлаб», Россия – регистрационное удостоверение № ФСР 2008/03335, действительно с 23 сентября 2008 года. Срок действия: не ограничен.

2. Анализатор автоматический бактериологический, например, VITEC-2 Compact, производство «биоМерье СА, Франция. Регистрационное удостоверение № ФСЗ 2010/6051, действительно с 25 января 2010 года. Срок действия: не ограничен.

3. Термостат (t 37 C), например, «Биндер ГмбХ», Германия. Регистрационное удостоверение № ФСЗ 2010/08132, дествительно с 26 октября 2010 года. Срок действия не ограничен.

4. Искусственные питательные среды: транспортная среда (например среда Стюарта), 5% кровяной агар, среда Сабуро, МРС-агар (агар Рагозы). Регистрационное удостоверение № ФСЗ 2009/04467 от 01 июня 2009 года. Срок действия: не ограничен. Настоящее удостоверение выдано «ЛАБОРАТОРИОС КОНДА, С.А.», Испания, производит сухие питательные среды специального назначения для микробиологии.

 

 

5. Описание новой медицинской технологии

Взятие материала для исследования проводит врач акушер-гинеколог.

После введения во влагалище зеркала и подъемника отделяемое берут стерильным дакроновым или ватным тампоном из заднего свода или с патологически измененных участков слизистой. С целью культурального исследования тампон помещают в стерильную пробирку и немедленно отправляют в лабораторию. Если это требование не может быть выполнено в течение 2 часов, взятую пробу помещают в пробирку с транспортной средой. С целью микроскопии взятую другим тампоном пробу отделяемого переносят на предметное стекло, перекатывая тампон всеми сторонами по стеклу, стараясь, чтобы материал распределился равномерно, сохраняя естественное взаиморасположение всех компонентов биоценоза. Мазок высушивают на воздухе, фиксируют 96% этиловым спиртом (2-3 капли на мазок до полного испарения), маркируют стекло и в закрытой ёмкости отправляют в микробиологическую лабораторию вместе с тампоном для посева.

В лаборатории проводят исследование вагинального отделяемого:

(1) - микроскопия мазка после окраски по Граму;

(2) - посев взятого тампоном отделяемого влагалища на факультативно-анаэробную группу микроорганизмов, грибы и микроаэрофилы (лактобациллы).

 

При микроскопии вагинального мазка, окрашенного по Граму, оценивают (увеличение х 1000):

- состояние вагинального эпителия: преобладают клетки поверхностного, промежуточного или парабазального слоёв, наличие «ключевых» клеток – поверхностных эпителиальных клеток, густо покрытых адгезированными на них мелкими грамвариабельными палочками, скрывающими границы клетки (рис.4), или «ложно-ключевых клеток – повышенная адгезия на эпителиальных клетках грамположительных палочек, чаще всего лактобацилл (рис.2).

- лейкоцитарную реакцию: её наличие, степень выраженности, проявление фагоцитоза, его завершенность;

- состав микрофлоры: количественная и качественная оценка её по морфологическим и тинкториальным свойствам.

При количественной характеристике микрофлоры мы используем критерии Nugent R.P. [6], несколько нами модифицированные [2]. Оценка общей микробной обсемененности проводится по 4-х-бальной системе по числу микробных клеток, обнаруживаемых в одном поле зрения при микроскопии с иммерсией:

+ - до 10 микробных клеток в поле зрения – минимальное (небольшое) количество;

+ + - от 11 до 100 микробных клеток в поле зрения – умеренное количество;

+ + + - от 100 до 1000 микробных клеток в поле зрения - большое количество;

+ + + + - более 1000 микробных клеток в поле зрения –

массивное количество.

Качественная оценка микрофлоры в грам-мазках включает дифференциацию морфотипов по их тинкториальным и морфологическим признакам. Различают морфотипы лактобацилл, фузобактерий, бактероидов, мобилункусов, лептотрихий, гарднереллы, вейлонеллы, а также грам(+) кокков, колиформных палочек, дрожжевых грибов. В мазке могут быть обнаружены трихомонады и другие паразиты.

Для характеристики факультативно анаэробной части микробиоты, а также лактобактерий, которые по морфологии могут быть сходными со многими видами грамположительных облигатно анаэробных бактерий, такими как клостридии, пропионибактерии, эубактерии и другие, необходим посев вагинального отделяемого. Для этих целей используют: 5% кровяной агар, как наиболее универсальную среду, на которой могут расти подавляющее большинство видов, имеющих клиническое значение, агар Сабуро (селективная среда для выделения грибов) и МРС-агар для культивирования лактобактерий. Посев на 0,5 чашки Петри с кровяным агаром проводят плотными непрерывными штрихами, используя тампон, которым брали отделяемое влагалища (для стандартизации количественной оценки роста колоний разных видов), затем тем же тампоном производят посевы на сектора среды Сабуро и лактобакагар (МРС-агар).

Выделение из патологического материала и идентификация различных видов семейства Enterobacteriaceae, стафилококков, стрептококков, неферментирующих бактерий, нейссерий, коринебактерий, грибов и других микроорганизмов после количественной оценки роста при первичном посеве, позволяет определить степень их этиологической значимости в развитии вагинита у конкретной пациентки. Или оценить состав микробиоты как нормоценоз.

Так как первичный посев биоматериала проводится тампоном, то количественная оценка микробного роста в перерасчёте в КОЕ/мл/г может быть только «условной» (полуколичественный метод). На основе эмпирических исследований можно предложить следующую шкалу оценки степени микробной обсемененности в зависимости от количества выросших колоний при прямом посеве биоматериала на 0,5 чашки кровяного агара:

 

0 – 10 колоний - минимальное количество (скудный рост)

до 10² КОЕ/тампоне/мл (< 2 lg КОЕ/мл)

11 – 100 колоний - небольшое количество

10² – 10³ КОЕ/тампоне/мл (2-3 lg КОЕ/мл)

>100 – 200 колоний - умеренное количество

10⁴ – 10⁵ КОЕ/тампоне/мл (4-5 lg КОЕ/мл)

>200 – 500 колоний - большое количество

10⁶ - 10⁷ КОЕ/тампоне/мл (6-7 lg КОЕ/мл)

Сливной рост колоний - массивное количество

Более 10⁷ КОЕ/ тампоне/мл (>7 lg КОЕ/мл)

 

В случаях, когда при микроскопии грам-мазка установлен диагноз БВ, результаты посева могут быть или отрицательными (роста микроорганизмов не обнаружено), или могут выявить повышенные титры УПМ (грибы, энтерококки, колиформные и другие бактерии), которые могут стать причиной осложнений после этиотропной терапии препаратами с антианаэробной активностью. Особенно следует иметь в виду микроорганизмы, которые даже в низких концентрациях являются факторами повышенного риска для заражения внутриутробного плода (листерии, стрептококки групп В и А).

Кроме диагностики БВ микроскопический метод имеет преимущества перед культуральным исследованием также при диагностике относительно редких в репродуктивном возрасте состояний вагинальной микроэкологии: цитолитического вагиноза, вагинальной эпителиальной атрофии и промежуточной формы микроценоза.

На основании изложенного предлагаются следующие микробиологические критерии оценки состояния микробиоты (микроценоза) влагалища по отдельным нозологическим формам у женщин репродуктивного возраста [2, 3]:

 

Нормоценоз

А. Микроскопия мазка, окрашенного по Граму (рис.1)

- вагинальный эпителий представлен клетками поверхностных слоёв, реже встречаются клетки промежуточного слоя (соотношение их может меняться в зависимости от фазы менструального цикла, во время беременности много промежуточных клеток; число их увеличивается при выраженном воспалительном процессе).Иногда (при повышенном уровне эстрогенов) встречаются «ложно-ключевые» клетки (рис. 2);

- лейкоцитарная реакция отсутствует или слабо выражена – единичные лейкоциты в поле зрения;

- общее количество микроорганизмов умеренное или большое;

- доминирующий морфотип – лактобациллы, другие морфотипы либо отсутствуют, либо их количество исчисляется единичными микробными клетками в редких полях зрения;

Б. Культуральное исследование

- общая микробная обсемененность 6 - 8 lg КОЕ/мл;

- абсолютное преобладание лактобацилл;

- УПМ могу быть в низком титре (< 4 lg КОЕ/мл) или отсутствуют.

 

Бактериальный вагиноз

А. Микроскопия мазка, окрашенного по Граму (рис. 3)

- вагинальный эпителий представлен клетками поверхностных слоёв, редко встречаются промежуточные клетки, часто – «ключевые» клетки (рис.4);

- лейкоцитарная реакция, как правило, отсутствует (если она выражена - следует думать о смешанной инфекции);

- общее количество микроорганизмов – массивное, реже - большое;

- преобладают морфотипы строгих анаэробов и гарднереллы; морфотипы лактобацилл отсутствуют или определяются как единичные не во всех полях зрения.

Б. Культуральное исследование:

- общая микробная обсемененность превышает 9 lg КОЕ/мл; при использовании только аэробных условий культивирования рост микроорганизмов отсутствует или наблюдается рост сопутствующих УПМ (факультативных анаэробов и аэробов) чаще в небольшом титре;

- полимикробный характер микрофлоры с абсолютным преобладанием облигатно анаэробных видов и гарднереллы;

- отсутствие роста лактобацилл, или титр их резко снижен (< 5 lg КОЕ/мл).

 

Кандидозный вагинит

В зависимости от концентрации грибов в отделяемом влагалища и сопутствующей микрофлоры мы выделяем 3 формы Candida-инфекции влагалища.

 

1. Кандидозный вагинит (классический вариант, при котором грибы – моновозбудитель):

А. Микроскопия мазка, окрашенного по Граму (рис. 5)

- вагинальный эпителий преимущественно поверхностных слоёв, но может быть много промежуточных и даже парабазальных клеток (пропорционально тяжести клинического течения заболевания);

- лейкоцитарная реакция от умеренной (10-15 лейкоцитов в поле зрения) до резко выраженной (30-50 и более лейкоцитов в поле зрения);

- общее количество микроорганизмов умеренное или большое;

- доминируют морфотипы лактобацилл, присутствуют дрожжевые клетки, фрагменты псевдомицелия с бластоспорами.

Б. Культуральное исследование

- общее количество микроорганизмов не превышает 8 lg КОЕ/мл;

- дрожжевые грибы присутствуют в титре > 4 lg КОЕ/мл;

- лактобациллы выявляются в титре более 6 lg КОЕ/мл.