Обнаружение бактериофага в жидкой питательной среде. Два пробирки с питательными средами засевают одной и той же культурой микроба, гомологичного искомому фагу. После 3-4-часового инкубирования в термостате в одну из пробирок (опытная) вносят фильтрат исследуемого материала. Вторая пробирка, содержащая питательную среду, засеянную культурой микробов, является контролем. Обе пробирки ставят в термостат при 37°C и через 24 ч учитывают результаты.
При учете результатов возможны следующие варианты:
1. Содержимое опытной пробирки прозрачно, в контроле – помутнение питательной среды. Это указывает на содержание в исследуемом фильтрате фага высокой активности.
2. В опытной пробирке имеется менее выраженное по сравнению с контролем помутнение среды. Это свидетельствует о содержании в исследуемом материале бактериофага средней активности.
3. При одинаковом помутнении в обеих пробирках для окончательного заключения об отсутствии бактериофага необходимо произвести дополнительное исследование: высев на плотную питательную среду содержимого опытной и контрольной пробирок. Высев делают на среду в чашки Петри шпателем, чтобы получить сплошной рост микробов. Чашки ставят в термостат и после 24 ч инкубирования при 37 °C учитывают результаты. Посев из контрольной пробирки дает сплошной рост микробов. При наличии фага в исследуемом материале на фоне сплошного роста микробов появляются стерильные пятна—колонии бактериофага.
Количественные методы обнаружения бактериофага
После выявления бактериофага в исследуемом материале необходимо определить его количественное содержание (титр фага). Для выражения титра бактериофага можно пользоваться двумя показателями: количеством активных частиц бактериофага, содержащихся в 1 мл исследуемого материала, или величиной наибольшего разведения, при котором бактериофаг проявляет свое литическое действие. Полученную при этом величину выражают отрицательным логарифмом 10, где степень указывает разведение фага.
Титрование бактериофага в жидкой питательной среде по методу Аппельмана. Метод Аппельмана основан на внесении различных количеств титруемого бактериофага в бульон, засеянный одной и той же дозой культуры гомологичных микробов, с целью получения феномена бактериофагии.
Двенадцать пробирок, содержащих по 4,5 мл мясопептонного бульона, ставят в штатив в один ряд. В первую пробирку стерильной пипеткой вносят 0,5 мл исследуемого фага. Содержимое пробирки перемешивают и 0,5 мл жидкости переносят во вторую пробирку, из второй—в третью и т.д. до десятой включительно. Из десятой пробирки лишние 0,5 мл выливают; одиннадцатая и двенадцатая пробирки—контрольные. Переносят жидкость из одной пробирки в другую каждый раз отдельной стерильной пипеткой емкостью 1 мл.
Во все 10 пробирок приготовленного ряда разведений вносят по 1 капле (0,03 мл) взвеси смыва суточной агаровой или бульонной культуры бактерий, одноименных титруемому фагу. Одиннадцатая пробирка-контроль культуры, содержит 5 мл бульона и 1 каплю культуры микробов. Двенадцатая пробирка – контроль на стерильность, содержит 5 мл бульона без фага и бактерий.
Учет результатов производят через 18-20 ч после инкубации в термостате при 37 °C.
Титром считают то максимальное разведение бактериофага, при котором наблюдается полный лизис чувствительной к нему культуры.
Титрование бактериофага на плотной питательной среде по методу агаровых слоев Грациа.
Метод агаровых слоев Грациа основан на внесении различных разведений титруемого бактериофага в соответствующую культуру бактерий и посеве смеси на плотную питательную среду с целью получения негативных колоний бактериофага.
В чашки Петри разливают мясопептонный агар в количестве 25-30 мл.
В пробирки с мясопептонным агаром, расплавленным в водяной бане и остуженным до температуры 44-46 °C, вносят по 1 мл титруемого фага. Одновременно с фагом в каждую пробирку вносят по 0,1 мл одноименной чувствительной к фагу культуры. Содержимое пробирок перемешивают, быстро вращая пробирки между ладонями, и выливают вторым слоем в чашки с агаром. После остывания среды чашки с посевом инкубируют при 37 С в течение 18-20 ч.
Титр фага определяют путем подсчета числа негативных колоний на параллельных чашках и умножением среднего арифметического на показатель разведения. Например, при посеве 1 мл фага в разведении 10-5 на одной чашке выявлено 128 негативных колонии, на второй—l46. Титр фага равен 1,37 х10 7.
Практическое применение бактериофагов