Качественные методы выявления бактериофага

Обнаружение бактериофага в жидкой питательной среде. Два про­бирки с питательными средами засевают одной и той же культурой микроба, гомологичного искомому фагу. После 3-4-часового инкубирования в термостате в одну из пробирок (опытная) вносят фильтрат исследуемого материала. Вторая пробирка, содержащая питательную среду, засеянную культурой микробов, является контролем. Обе пробирки ставят в термостат при 37°C и через 24 ч учитывают результаты.

При учете результатов возможны следующие варианты:

1. Содержимое опытной пробирки прозрачно, в контроле – помутнение питательной среды. Это указывает на содержание в исследуемом фильтрате фага высокой активности.

2. В опытной пробирке имеется менее выраженное по сравнению с контролем помутнение среды. Это свидетельствует о содержании в исследуемом материале бактериофага средней активности.

3. При одинаковом помутнении в обеих пробирках для окончательного заключе­ния об отсутствии бактериофага необходимо произвести дополнительное иссле­дование: высев на плотную питательную среду содержимого опытной и контроль­ной пробирок. Высев делают на среду в чашки Петри шпателем, чтобы получить сплошной рост микробов. Чашки ставят в термостат и после 24 ч инкубирования при 37 °C учитывают результаты. Посев из контрольной пробирки дает сплошной рост микробов. При наличии фага в исследуемом материале на фоне сплошного роста микробов появляются стерильные пятна—колонии бактериофага.

Количественные методы обнаружения бактериофага

После выявления бактериофага в исследуемом материале необходимо опреде­лить его количественное содержание (титр фага). Для выражения титра бактериофага можно пользоваться двумя показателями: количеством активных частиц бактериофага, содержащихся в 1 мл исследуемого материала, или величиной наибольшего разведения, при котором бактериофаг проявляет свое литическое действие. Полученную при этом величину выражают отрицательным логарифмом 10, где степень указывает разведение фага.

Титрование бактериофага в жидкой питательной среде по методу Аппельмана. Метод Аппельмана основан на внесении различных количеств титруемого бактериофага в бульон, засеянный одной и той же дозой культуры гомологичных микробов, с целью получения феномена бактериофагии.

Двенадцать пробирок, содержащих по 4,5 мл мясопептонного бульона, ставят в штатив в один ряд. В первую пробирку стерильной пипеткой вносят 0,5 мл ис­следуемого фага. Содержимое пробирки перемешивают и 0,5 мл жидкости пере­носят во вторую пробирку, из второй—в третью и т.д. до десятой включитель­но. Из десятой пробирки лишние 0,5 мл выливают; одиннадцатая и двенадцатая пробирки—контрольные. Переносят жидкость из одной пробирки в другую каж­дый раз отдельной стерильной пипеткой емкостью 1 мл.

Во все 10 пробирок приготовленного ряда разведений вносят по 1 капле (0,03 мл) взвеси смыва суточной агаровой или бульонной культуры бактерий, одноименных титруемому фагу. Одиннадцатая пробирка-контроль культуры, содержит 5 мл бульона и 1 каплю культуры микробов. Двенадцатая пробирка – контроль на стерильность, содержит 5 мл бульона без фага и бактерий.

Учет результатов производят через 18-20 ч после инкубации в термостате при 37 °C.

Титром считают то максимальное разведение бактериофага, при котором наблюдается полный лизис чувствительной к нему культуры.

Титрование бактериофага на плотной питательной среде по методу агаровых сло­ев Грациа.

Метод агаровых слоев Грациа основан на внесении различных разведений титруемого бактериофага в соответствующую культуру бактерий и посеве смеси на плотную питательную среду с целью получения негативных колоний бактериофага.

В чашки Петри разли­вают мясопептонный агар в количестве 25-30 мл.

В пробирки с мясопептонным агаром, расплавленным в водяной бане и остуженным до температуры 44-46 °C, вносят по 1 мл титруемого фага. Одновременно с фагом в каждую пробирку вносят по 0,1 мл одноименной чув­ствительной к фагу культуры. Содержимое пробирок перемешивают, быстро вра­щая пробирки между ладонями, и выливают вторым слоем в чашки с агаром. После остывания среды чашки с посевом инкубируют при 37 С в течение 18-20 ч.

Титр фага определяют путем подсчета числа негативных колоний на параллельных чашках и умножением среднего арифмети­ческого на показатель разведения. Например, при посеве 1 мл фага в разведении 10-5 на одной чашке выявлено 128 негативных колонии, на второй—l46. Титр фага равен 1,37 х10 ⁷.

Практическое применение бактериофагов