Продуценты лимонной кислоты

После первых публикаций К.Вемера о способностях микромицетов синтезировать органические кислоты, в том числе лимонную, многие микробиологи стали тщательно изучать физиологию грибов и их биосинтетические способности. Многочисленные проверки по­казали явно выраженный потенциал сверхсинтеза лимонной кис­лоты у целого ряда микромицетов, дрожжевых грибов и бактерий. В зависимости от химической природы окисляемого субстрата (свекловичная, тростниковая, цитрусовая или финиковая меласса, сок сахарного тростника, гидрол, гидролизаты крахмала, багасса, сахароза, глюкоза, парафины и много других субстратов) в ка­честве продуцентов лимонной кислоты в более или менее широких масштабах используют микромицеты, принадлежащие к родам Aspergillus, Penicillium, Trichoderma и Botrytis, дрожжевые грибы родов Candida, Delaromyces и Torulopsis, а также бактерии родов Arthrobacterium, Pseudomonas и Micrococcus.

Детально изучены многочисленные представители аспергиллов, особенно Aspergillus awamori, A.aureus, A.clavatus, A.glaucus, A.ni­ger.

Самым широко распространенным продуцентом лимонной кис­лоты является микромицет Aspergillus niger, физиология и меха­низм биосинтеза лимонной кислоты которого наиболее изучены.

В настоящее время для биосинтеза лимонной кислоты в ка­честве основного сырья широко используют мелассу — отходы сахароперерабатывающей промышленности. В зависимости от исход­ного материала различают свекловичную, тростниковую, цитрусо­вую и другие виды мелассы. На международном рынке ежегодна продается 30—35 млн. т этого сырья. В России ежегодный объем производства мелассы составляет 3 млн. т. Хотя меласса в основ­ном используется для кормовых целей, ее широко применяют также в микробиологической промышленности.

Свекловичная меласса характеризуется высоким содержанием 'Сахаров (46—55%), из которых преобладает сахароза. Меласса имеет сложный и непостоянный химический состав. Она содержит коллоиды, органические кислоты, витамины, белки и свободные.аминокислоты, сложный спектр минеральных веществ (табл. 4.8— 4.10). Из нелетучих органических кислот в мелассе могут при­сутствовать, %: лимонная — 0,01—0,5; глюконовая — 0,5—1,0; яблочная — 0,1—0,5; янтарная — 0,1—0,7.

Хорошо сбраживаемая меласса должна содержать не более 1% инвертного сахара и не более 1% СаО и 0,06,% сернистого газа (добавляемого в мелассу в качестве консервирующего агента) при общем содержании сухих веществ не менее 75% и Сахаров не менее 46,% при невысоком содержании живых микроорганизмов.

В золе свекловичной мелассы много калия, магния, железа, но относительно мало фосфора.

Химический состав мелассы зависит от климатических и поч­венных условий

выращивания сахарной свеклы, применяемых ми­неральных удобрений, времени уборки урожая (поздние сроки уборки отрицательно влияют на качество мелассы), технологичес­ких нюансов переработки сахарной свеклы, условий транспорти­ровки и хранения мелассы.

Производство мелассы связано с сезонными доставками сырья. В производстве лимонной кислоты наилучшие результаты дает зрелая, выдержанная меласса. Важное значение имеют длитель­ность хранения мелассы и наличие герметически закрытых ем­костей — мелассохранилищ с пневматическим перемешиванием (для предотвращения расслоения), насосами, устройствами для подачи и забора мелассы из разных горизонтальных хранилищ.

В последнее десятилетие качество мелассы ухудшается под влиянием ряда дополнительных факторов, связанных с техничес­ким прогрессом. Широко применяемые в сельском хозяйстве ядохимикаты и минеральные удобрения могут оставлять опреде­ленные отрицательные следы в сельскохозяйственной продукции, в частности в мелассе, где обнаружены инсектициды, например фосфорорганический инсектицид малатилон (до 90 мг в 1 кг ме­лассы), оказывающий ингибирующее влияние на биосинтез лимон­ной кислоты.

В мелассе установлено присутствие некоторых фунгицидов (трилон, мертрилан и др.). Данные о влиянии фунгицидов на биосинтез лимонной кислоты неоднозначны. Некоторые авторы ут­верждают, что ряд фунгицидов подавляет активность ферментов изоцитрат- и сукцинатдегидрогеназы и тем самым способствует биосинтезу лимонной кислоты, во всяком случае у дикорастующих культур Aspergillus niger. По данным других авторов, фунги­циды отрицательно влияют на ацидогенез.

Обнаружено угнетение синтеза белка в клетках Aspergillus niger под действием ртутьорганического фунгицида мертрилана. В результате его воздействия на ферменты ЦТК (в частности на малат-, изоцитрат- и сукцинатдегидрогеназы) резко понижаются интенсивность дыхания клеток и активность терминальных оксидо-редуктаз, особенно цитохромоксидазы. Фунгицид трилан (4,5,6-трихлорбензоксазолидон) также отрицательно влияет на метабо­лизм микромицета Aspergillus niger, по механизм его воздействия другой.

Все исследованные фунгициды подавляют интенсивность дыхания, тормозят синтез белка, нарушают проницаемость цитоплазматических мембран.

В мелассе нередко обнаруживается присутствие детергентов.Их влияние на микроорганизмы изучено слабо. Установлено изменение проницаемости клеточной мембраны Aspergillus niger и как следствие — повышенная гидроксилазная активность культуры.

Способ культивирования

Успехи глубинной ферментации в производстве антибиотиков побудили производителей лимонной кислоты искать пути глубин­ного культивирования ее продуцентов. В СССР первой глубинное культивирование продуцентов лимонной кислоты освоила группа исследователей под руководством Г. И. Журавского в 50-е гг., при­меняя синтетические сахарозные среды и специально

селекциони­рованный для глубинного культивирования штамм Aspergillus ni­ger {. В качестве сырья для глубинной ферментации лимонной кислоты может быть использован широкий набор природных суб­стратов: меласса, глюкоза, сахароза, жидкие парафины и другие источники углерода.

Технология глубинного культивирования продуцентов лимонной кислоты представляет собой явно выраженный двухступенчатый процесс. Первая ступень включает выращивание посевного мате­риала из конидиоспор в посевной среде (на качалке и в посевном аппарате) при 32—33 °С в условиях хорошей аэрации (0,8—1,0 объ­ема воздуха на 1 объем среды в минуту) и при непрерывном пе­ремешивании среды. Продолжительность культивирования на ста­дии выращивания посевного материала — 2 сут (1 сут — на ка­чалке, 1 — на посевном аппарате).

Сказанное принципиально не исключает непосредственного применения конидиоспор в качестве посевного материала для ос-

новной ферментации, однако это существенно удлиняет цикл фер­ментации: с 7—8 до 12—13 сут.

Основную ферментацию в глубинных условиях осуществляют в производственном биореакторе при коэффициенте его заполнения 0,75—0,80 и количестве посевного материала 5—8% от объема ферментируемой среды. Начальная концентрация Сахаров — 10— 14%, часто применяют подкормку свежей средой, особенно в слу­чаях применения мелассных сред. Регуляции рН среды не требуется, но поскольку лимонная кислота очень коррозионна и для ферментационного оборудования необходима устойчивая к кор­розии сталь, то для смягчения коррозионное практикуют подщелачивание ферментируемого субстрата до рН 3,8—4,2.

Процесс ферментации имеет черты двух фаз, или стадий: фор­мирования биомассы и кислотообразования.

Для фазы роста биомассы характерно объединение молодого мицелия в шарообразные агломераты, формирование которых про­должается до 70—80 ч ферментации. Некоторая часть гиф остается в свободном виде.

Во время интенсивного роста потребность продуцента в моле­кулярном кислороде составляет до 1 кг па каждый кубометр фер­ментируемого субстрата в час. В фазе биосинтеза лимонной кислоты потребность в кислороде в некоторой степени снижается и состав­ляет 0,5—0,6 кг 0₂/м³-ч. Для обеспечения массопередачи кисло­рода в ферментируемый субстрат вводится стерильный воздух в количестве 0,8—1,0 объема на 1 объем среды в минуту, одновре­менно с помощью мешалки создается циркуляция среды со ско­ростью, соответствующей 1,2—1,5 м/с вдоль стенки ферментатора. Насыщение среды кислородом в начальной фазе ферментации должно составлять 20—25,% от полного насыщения, в фазе био­синтеза лимонной кислоты — 10—15,%. Для обеспечения массооб-меиа молекулярного кислорода необходим расход электроэнергии в количестве 1,8—2,2 кВт на 1 м³ среды.

Температурные режимы в ферментируемом субстрате дифферен­цированы: в фазе роста биомассы — 32—33 °С, в фазе кислотообра­зования — 30—31 °С.

В зависимости от особенностей используемого мутанта Asper­gillus niger применяют разные варианты технологических режимов глубинной технологии.