Метилирование/деметилирование ДНК в эмбриональных стволовых клетках.

Введение.

Все клетки организма, а их около 200 типов, происходят из единственной клетки – зиготы. Для развития эмбриона требуется значительное увеличение клеточной массы, а затем дифференцировка в различные клеточные типы, которые сформируют определенные ткани и органы организма. Такое под силу только внутренней клеточной массе (ВКМ) предимплантационной бластоцисты. Если культивировать эти клетки in vitro в присутствии подавляющих дифференцировку сигналов, то можно получить клеточные линии, называемые эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК). Линии ЭСК могут быть также получены из одного бластомера 8-клеточного эмбриона и подвергнуты диффренцировке в различные клеточные типы под воздействием определенных факторов. ЭСК характеризуются способностью возобновлять себя и дифференцироваться в различные типы клеток (плюрипотентность).

Все клетки организма имеют идентичный геном, хотя очень сильно различаются морфологически и функционально. Эти различия являются результатом экспрессии или инактивации различных генов посредством эпигенетических изменений, которые могут репрограммировать работу генома в процессе развития организма.

Эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов можно определить как наследственный код, отличный от геномной последовательности нуклеотидов, который включает пост-трансляционную модификацию гистонов, ДНК-метилирование цитозина в CpG-динуклеотидах, АТФ-зависимый ремоделлинг хроматина, обмен гистонов и их вариантов и различные типы малых РНК, которые участвуют в инактивации и экспрессии генов. На самом деле, имеет смысл выделить три краеугольных эпигенетических механизма регуляции экспрессии генов: метилирование ДНК, модификацию гистонов и РНК-интерференцию (Рис. 1). Указанные эпигенетические механизмы вовлечены в регуляцию экспрессии и инактивации генов на уровне транскрипции посредством плотности упаковки ДНК и гистонов в хроматин. Экспрессия генов тесно связана с состоянием хроматина. Для активного хроматина (эухроматина) характерно «рыхлое» расположение нуклеосом на ДНК, наличие факторов ремоделирования хроматина, более свободный доступ к ДНК для эндонуклеаз, репликация локуса ДНК в начале S-фазы, пространственное перемещение (выпетливание) хроматина в районах конститутивного гетерохроматина. Неактивный хроматин (гетерохроматин) обладает противоположными характеристиками.

Рис. 1. Три основных эпигенетических механизма регуляции экспрессии генов: метилирование ДНК, модификация гистонов, РНК-интерференция.

Эпигенетические метки, такие как метилирование ДНК и модификации гистонов, могут быть скопированы в S-фазе и, следовательно, эпигенетическая информация может быть передана через ряд последовательных клеточных делений. Эта особенность «эпигенетического наследования» привела к тому, что состоянию хроматина стали отводить центральную роль в поддержании транскрипционных характеристик генома в процессах развития, в том числе, и в поддержании плюрипотентности стволовых клеток (СК). Однако не следует забывать, что эпигенетическая регуляция является крайне сложным комплексным процессом, когда все три основные составляющие работают во взаимодействии. Так, метилирование ДНК может вызвать деацетилирование и метилирование/деметилирование гистоновых белков, метилирование/деметилирование гистонов может привести к метилированию ДНК, малые РНК в составе сложных белковых комплексов могут вызывать метилирование ДНК, модификации гистонов, а так же напрямую инактивировать тот или иной ген в процессах развития посредством РНК-интерференции (блокирование трансляции или деградация мРНК). Поэтому имеет смысл коротко рассмотреть три основных варианта эпигенетической регуляции, как таковых, а затем в процессах раннего эмбрионального развития и в ЭСК.

Основные эпигенетические механизмы, регулирующие экспрессию генов.

Метилирование/деметилирование ДНК в эмбриональных стволовых клетках.

Эпигенетические изменения, основанные на метилировании ДНК, и последующая инактивация определенных генов требуются для того, чтобы запустить процессы дифференцировки. Это было показано при исследовании ЭСК, дефектных либо по метилтрансферазам Dnmt1, Dnmt 3a и Dnmt3b, либо по белку CGBP, который связывается с неметилированной ДНК в районах CpG-островков (Табл 1). В таких клетках было выявлено гипометилирование ДНК и полная невозможность дифференцировки. Первоначально, почти все метилированные цитозины в ДНК, унаследованные от материнской и отцовской гамет, деметилируются в оплодотворенной яйцеклетке (Рис. 5).

Затем происходит восстановление метилирования во время имплантации эмбриона. Однако, CpG-островки, которые контролируют экспрессию генов,

Табл. 1. Фенотипические проявления мутаций ДНК-метилтрансфераз и метилсвязывающих белков.

Рис. 5. Динамика деметилирования на ранних стадиях эмбриогенеза.

остаются неметилированными на этой стадии, а метилирование de novo и инактивация генов происходит после имплантации. Этот механизм отвечает за инактивацию гена Oct4 и генов на инактивированной Х-хромосоме женских эмбрионов в постимплантационную стадию.

Было показано, что количество генов, активно экспрессирующихся в недифференцированных ЭСК, намного превышает количество таковых в тканях взрослого организма. Когда ЭСК начинают дифференцироваться в определенный клеточный тип, большое количество генов, поддерживавших плюрипотентность, выключается, а начинают работать гены, чья экспрессия характерна для определенной ткани. Это связано с тем, что значительное число CpG-островков в ЭСК поддерживается в неметилированном состоянии и доступно для транскрипции. Эмбриональные клетки in vitro с пособны быстро деметилировать трансфецированную ДНК, CpG-островки которой полностью метилированы, это подтверждает способность ЭСК поддерживать регуляторные районы многих генов в неметилированном состоянии, тем самым осуществляя их экспрессию. Практически моментальная потеря связывания хроматин-ассоциированных белков в ЭСК также способствует транскрипционной доступности и плюрипотентности этих клеток.

Табл. 2. Фенотипические проявления мутаций белков, осуществляющих модификации гистонов и ремоделлинг хроматина.

1.2.3. Эпигенетические м одификации гистонов в ЭСК.

Было установлено, что хроматин менее плотно упакован, а значит транскрипционно активен в недифференцированных ЭСК, по сравнению с дифференцированными клетками. Дифференцировка ЭСК приводит к более плотной упаковке перицентромерного гетерохроматина в результате деацетилирования гистона H4 в этих районах. В дифференцированных клетках многие инактивированные гены располагаются вблизи центромерного гетерохроматина, хотя в ЭСК такой пространственной компартментализации инактивированных генов не наблюдается.

Время репликации также является важной характеристикой состояния хроматина. Первоначально считалось, что репликация в начале S-фазы свидетельствует о транскрипционной активности генов. В последнее время показано, что время репликации зависит от состояния хроматина, а не от транскрипции и достаточно хорошо коррелирует с ацетилированием гистонов. Было показано, что значительное количество генов, кодирующих факторы транскрипции и не экспрессирующихся в ЭСК, потому что они необходимы для более поздних стадий развития, все-таки реплицируются в начале S-фазы.

1.2.3.1.Бивалентное состояние хроматина и PcG репрессоры.

Описание свойств хроматина ЭСК необходимо для понимания молекулярных характеристик, свойственных плюрипотентному статусу. Исследования хроматина на глобальном уровне, в определенных локусах и в конкретных районах локализации генов, регулирующих процессы развития показали, что многие нетранскрибирующиеся гены в ЭСК имеют хроматиновые метки, которые обычно ассоциированы с активно транскрибирующимися генами, представленные высоким уровнем ацетилирования гистонов H3 и H4, а так же ди- и триметилированием лизина 4 гистона H3. Удивительно, но промоторы этих генов обогащены и репрессирующей транскрипцию меткой, представленной триметилированием лизина 27 гистона H3 (Рис. 10). Практически получается, что активирующие и инактивирующие транскрипцию эпигенетические метки хроматина присутствуют в одно и тоже время в одном и том же месте.

Такая необычная «бивалентная» структура хроматина преимущественно возникает в промоторных районах высоко консервативных генов в ЭСК, включая семейства транскрипционных факторов Sox, Fox, Pax, Irx и Pou. Уникальный паттерн модификации гистонов в ЭСК поддерживает их плюрипотентность и инактивацию тканеспецифических генов за счет доминирующего эффекта метилирования Н3К27 по сравнению с метилированием Н3К4. Таким образом, гены, которые контролируют

Рис. 10. В ЭСК хроматиновые метки, которые обычно ассоциированы с активно транскрибирующимися генами имеют высокий уровень ацетилирования гистонов H3 и H4, а так же ди- и триметилирование H3К4. Промоторы этих генов обогащены и репрессирующей транскрипцию меткой, представленной триметилированием H3К9 и Н3К27.

процессы дифференцировки в ЭСК, расположены в относительно «доступной» конформации хроматина, которая поддерживается за счет баланса метилирования Н3К27 и Н3К4. Метилирования Н3К9 в районах хроматина, содержащих «бивалентную» метку, как правило, не обнаруживается, т.к. оно более характерно для структурного гетерохроматина. Когда ЭСК начинают дифференцироваться, репрессирующая модификация гистона Н3 снимается и экспрессия генов запускается. Необходимо отметить, что ряд генов, которые осуществляют начальные этапы дифференцировки ЭСК, не имеют бивалентной хроматиновой метки, хотя располагаются в районах доступного хроматина и временно инактивированы. Вполне вероятно, что они регулируются пока еще не охарактеризованным эпигенетическим механизмом. В дифференцированных и прогениторных клетках триметилирование H3K27 присутствует в промоторных районах многих нетранскрибирующихся генов, но меток активного хроматина уже не обнаруживается. Это новая модель регуляции генов в плюрипотентных клетках, где многие тканеспецифические регуляторные гены эпигенетически помечены для последующей экспрессии, но в ЭСК находятся в состоянии «низкого старта» (Рис. 11).

Метилирование H3K27 катализируется белковым комплексом, относящимся к семейству PcG белков. PcG репрессоры были охарактеризованы как мультибелковые комплексы, необходимые для инактивации ряда генов, в том числе Hox - семейства, в развивающемся эмбрионе. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что эти белки выполняют важную роль в ЭСК.

Мишенями PcG являются регуляторы транскрипции, которые инактивированы в плюрипотентных клетках, но начинают экспрессироваться при дифференцировке клеток. Многие из этих генов имеют бивалентное состояние хроматина в ЭСК. В эксперименте показано, что в ЭСК, в которых

отсутствуют белки PcG, начинают экспрессироваться тканеспецифические гены.

Существует, по крайней мере, четыре различных PcG комплекса, два из которых необходимы для нормального функционирования ЭСК – PRC (Polycomb repressor complexes) 1 и 2. Метилирование Н3К27 катализируется PRC2, в состав которого входят белки EED, SUZ12, EZH12. Метилированный Н3К27 создает сайт связывания для PRC1, который содержит белки RING1A, RING1B и BMI1. В ЭСК, где RING1B не функционирует, начинают экспрессироваться транскрипционные факторы, такие как Msx1, HoxA7, Gata4,

которые так же начинают экспрессироваться в случае отсутствия EED. Таким образом, оба PRC комплекса участвуют совместно в подавлении транскрипции.

Возможно, существует и другой путь регуляции транскрипции в ЭСК. Показано, что PRC комплексы могут пространственно сближать определенные геномные локусы, расположенные далеко друг от друга, даже на разных

Рис. 11. Бивалентная метка хроматина тканеспецифичных генов, инактивированных в ЭСК.

хромосомах. Это приводит к включению механизмов репрессии транскрипции, основанных на формировании более высокой по организации структуры хроматина. Но, скорее всего, эти белки локально влияют на инициацию транскрипции и ремоделирование нуклеосом. Связывание PcG белков, вероятно, нарушает собственно топологию ДНК, что приводит к формированию негативных суперспиральных витков. Кроме того, эти белки обладают РНК-связывающими свойствами, а это может приводить к РНК-зависимому формированию гетерохроматина. Согласно такой возможности, один из ключевых компонентов РНК интерференции - белок Argonaute 1, обнаружен совместно с PcG комплесами в промоторных районах инактивированных генов.

Один из ключевых PcG белков - EZH2, имеет свойство привлекать ДНК-метилтрансферазы к определенным мишеням. В ЭСК такая роль указанного белка может являться важным компонентом в непростой взаимосвязи между плюрипотентностью и канцерогенезом. Районы метилирования Н3К27 в опухолевых клетках, но не при нормальном развитии, подвергаются метилированию ДНК de novo. Поскольку метилирование ДНК может стабилизировать инактивацию гена, то почему не предположить, что в ЭСК такой механизм осуществляет инактивацию генов, ответственных за пролиферацию и дифференцировку. В результате популяция СК становится нечувствительной к сигналам дифференцировки, что приводит к постоянному самовозобновлению клеток и, возможно, формированию опухоли.

1.3.2.Микро РНК и РНК интерференция в эмбриональных стволовых клетках.