Ранние бластомеры, примерно до 8-клеточной стадии, практически идентичны в плане тотипотентности. Однако, уже на стадии 4-х клеток каждый бластомер, скорее всего, имеет свою программу по вкладу в формирование ВКМ и трофэктодермы. На 8-клеточной стадии каждый бластомер поляризуется и делится либо симметрично, давая две полярных внешних клетки (ВК), или асимметрично, давая одну неполярную клетку ВКМ и одну полярную ВК. Таким образом, между 8- и 16-клеточной стадиями происходит формирование двух групп клеток: клеток ВКМ, являющихся плюрипотентными предшественниками примитивной эктодермы, и ВК, формирующих трофэктодерму. Принципиальных различий эпигенетического статуса ВКМ и ВК на стадии морулы пока не выявлено, но этого нельзя исключить, т.к. ключевые транскрипционные факторы, экспрессировавшиеся совместно в бластомерах (Oct4, Cdx2), продолжают экспрессироваться порознь: в ВКМ - Oct4, а во ВК – Cdx2.
На стадии бластоцисты эпигенетические различия между ВКМ и ВК уже хорошо различимы. В женских эмбрионах в течение предимплантационного развития «импринтированная» отцовская Х-хромосома преимущественно инактивирована. На отцовской Х-хромосоме экспрессируется некодирующая РНК гена Xist. Это вызывает модификацию гистонов, заключающуюся в потере H3K4me2 и H3K4me3, и в появлении H3K9me2 и H3K27me3. Первоначально, во всех клетках бластоцисты поддерживается эпигенетическая маркировка инактивированной отцовской Х-хромосомы, тогда как в поздней бластоцисте в клетках примитивной эктодермы эта маркировка стирается и обе Х-хромосомы становятся потенциально активными. Отцовская Х-хромосома остается инактивированной только в клетках трофэктодермы и примитивной эндодермы. Стирание импринта отцовской Х-хромосомы происходит в ВКМ в плюрипотентных клетках примитивной эктодермы. Когда последние начинают дифференцироваться, происходит случайная инактивация Х-хромосомы.
Серьезные различия эпигенетического статуса в ВКМ и клетках трофэктодермы касаются не только модификации гистонов, но и уровня метилирования ДНК. Вслед за пассивным деметилированием ДНК в течение предимплантационного развития, ВКМ бластоцисты начинают восстанавливать ДНК-метилирование, которое ассоциировано с ограниченной экспрессией Dnmt3b. В свою очередь, клетки трофэктодермы остаются относительно деметилированными. Это является отражением механизмов, используемых для поддержания геномного импринта в плаценте и в эмбрионе, они включают, как минимум, модификацию гистонов и метилирование ДНК. Эпигенетические события в клетках примитивной эктодермы сопровождаются изменениями клеточного цикла и делениями. Деления дробления, приводившие к уменьшению размеров клетки, заменяются на нормальное деление, сопровождающееся ростом клеток.
2.2.4. От предимплантации до постимплантации.
После имплантации бластоцисты плюрипотентные клетки примитивной эктодермы начинают формировать эпибластные клетки, которые начинают очень быстро делиться, и по началу сохраняют плюрипотентность. Эпибласты, однако, по профилю экспрессии генов, уже отличаются от клеток примитивной эктодермы. Например, поддерживающий плюрипотентность ген Nanog, а так же PGC7/stella и Rex1, быстро инактивируются в эпибластах, тогда как гены Fgf5 и Prce начинают экспрессироваться. Тем не менее, эпибластные клетки можно считать плюрипотентными, т.к. из них получаются все соматические ткани и половые клетки. Примечательно, что также как из клеток примитивной эктодермы можно получить ЭСК, существует возможность получения плюрипотентных стволовых клеток, имитирующих эпибласты, но отличающиеся по своим характеристикам от ЭСК. Предполагается, что плюрипотентные стволовые клетки, полученные из постимплантационного эмбриона имеют более стабильное эпигенетическое состояние, по сравнению с ЭСК, полученными из ВКМ.
Период между пре- и постимплантацией наиболее чувствителен к эпигенетической регуляции, т.к. необходимо поддерживать плюрипотентность примитивной эктодермы, а затем эпибластов, в процессе их подготовки к дифференцировке в различные клеточные типы, в то же время не допустить их дифференцировки в клетки трофэктодермы. В то время как предимплантационное развитие характеризуется как стиранием, так и поддержанием эпигенетических модификаций, постимплантационное развитие, в первую очередь, характеризуется установлением новых эпигенетических модификаций. Поэтому не удивительно, что ключевые метилтрансферазы гистонов, такие как Ezh2, Eset, G9a и компоненты NuRD-комплекса оказывают критическое влияние на развитие именно в период пре-/постимплантации. Ключевые эпигенетические модификаторы, участвующие на ранних стадиях развития представлены в таблицах 1, 2, 3. Переход от тотипотентной зиготы к плюрипотентным клеткам примитивной эктодермы является одним из ключевых результатов раннего развития. Транскрипционные факторы, включая Nanog, Oct4, Sox2 и Cdx2, важны в развитии до стадии бластоцисты. Характерным признаком постимплантационного развития является включение различных репрессирующих механизмов, таких как метилтрансферазы гистонов, репрессоры транскрипции, микро РНК, ДНК-метилтрансферазы, которые регулируют переход от клеток примитивной эктодермы к эпибластным клеткам. Их роль заключается не только в простом поддержании плюрипотентности в постимплантационных эпибластах, когда Nanog, PGC7 и др. гены выключаются, но так же и для предотвращения преждевременной и эктопической экспрессии тканеспецифических генов. Таким образом, ранние стадии развития требуют очень тонкого баланса между активностью транскрипционных и эпигенетических факторов.
2.3. Генетическая/эпигенетическая регуляция плюрипотентных стволовых клеток.
Плюрипотентные клетки примитивной эктодермы ВКМ и ранние примордиальные герминальные клетки могут дать начало плюрипотентным ЭСК и ЭГК в культуре. Однажды возникнув, ЭСК и ЭГК могут поддерживать свое недифференцированное и плюрипотентное состояние самостоятельно.
В настоящее время очень мало известно о том, как клетки примитивной эктодермы ВКМ трансформируются в ЭСК и какие эпигенетические регуляторы участвуют в этом процессе. Вероятно, уже на стадии бластоцисты клетки примитивной эктодермы претерпевают решающие стадии эпигенетического репрограммирования, включая стирание эпигенетических модификаций, ассоциированных с инактивацией Х-хромосомы и, возможно, полной дерепрессией генома. Плюрипотентные ЭСК приобретают состояние, которое очень непродолжительно возникает in vivo, т.к. клетки примитивной эктодермы достаточно быстро переходят в стадию эпибластных клеток.
Получение линий ЭСК происходит обычно в присутствии LIF, FCS или BMP4 и FGF2. Это способствует отбору клеток, которые могут дать ЭСК. Транскрипционные факторы Oct4, Nanog и Sox2 экспрессируются в ВКМ и поддерживают плюрипотентность стволовых клеток. Взаимодействие между Oct4 и Cdx2 является необходимым фактором в определении судьбы клеток – ВКМ или трофэктодерма. Индуцированная экспрессия Cdx2 в ЭСК приводит к дифференцировке в клетки трофэктодермы.
Плюрипотентность ЭСК поддерживается необычным состоянием их хроматина. Было показано, что хроматин ЭСК находится в высоко динамичном состоянии, но преимущественно деконденсированном. Это определенное состояние хроматина в ЭСК дополняется уникальным эпигенетическим механизмом поддержания плюрипотентности. Большое количество генов, необходимых для развития, имеют H3K27me3 репрессирующую метку. Однако, в то же самое время, эти районы имеют H3K4me3 метку, которая характерна для экспрессирующихся генов. Наличие таких двойных противоположных по значению эпигенетических меток заставляет предполагать, что инактивированные гены готовы перейти в экспрессирующееся состояние, как только линия ЭСК начнет дифференцироваться («низкий старт»). Такие двойные метки так же ассоциированы с рядом высоко консервативных некодирующих элементов. Многие сайты с бивалентной меткой связываются Oct4, Sox2 и Nanog – ключевыми факторами плюрипотентности. Гены-мишени указанных транскрипционных факторов имеют репрессирующие хроматиновые метки, но реплицируются в начале S-фазы в ЭСК, что также указывает на то, что эти районы готовы к экспрессии в любой подходящий момент.
Мутации в нескольких ключевых эпигенетических регуляторах, включая Ezh2, Eset, MBD3 и Dicer, нарушают возможность получения ЭСК из клеток ВКМ. Некоторые из этих белков, такие как Mbd3 и Dicer могут быть без последствий делетированы после того, как получены линии ЭСК. Это подтверждает предположение, что различные наборы молекулярных факторов необходимы для возникновения и поддержания плюрипотентности.