При заборе материала для гистологического исследования необходимо соблюдать основные общие правила и вместе с тем учитывать особенности изучаемого органа.
Органы и ткани, из которых предполагается изготавливать препараты, должны быть по возможности свежими и сохранными. В противном случае, посмертные изменения не позволяют оценить реальную прижизненную ситуацию в органах и тканях. Препараты лучшего качества получают из экспериментального, биопсийного и операционного материала. Обычно забирают кусочки размером 10*10*5 мм. [2]
Взятый для гистологического исследования материал сразу же должен подвергаться фиксации. Фиксация – метод обработки ткани с целью закрепления ее прижизненной структуры. Это достигается путем воздействия на ткань специальных растворов (фиксаторов). Наиболее существенным изменением, происходящим в тканях под воздействием фиксатора является процесс свертывания (коагуляции) белков. Количество фиксатора следует брать в 15-30 раз больше объема кусочка фиксируемого материала.
Наиболее широко применяется недорогой фиксатор формалин. Формалин легко диффундирует в ткани, применим для общих и для многих специальных и гистохимических методов окраски. Ткани можно не только фиксировать, но и хранить в растворах формалина. Критерием достаточной фиксации является равномерное уплотнение и обесцвечивание образца на контрольном разрезе. [3]
После фиксации материал промывают (чаще всего в течение нескольких часов в проточной воде) с тем, чтобы избавить его от избытка фиксатора и различных осадков фиксирующих жидкостей.
Изучить с помощью микроскопа такие фиксированные кусочки органов невозможно, т.к. они не прозрачны. Чтобы кусочек органа можно было микроскопировать, его надо разрезать на очень тонкие пластинки – срезы, толщина которых измеряется в микрометрах. Такие срезы получают с помощью специальных приборов – микротомов. Но для того, чтобы резать на микротоме кусочек ткани, ее надо предварительно уплотнить. Это достигается путем пропитывания застывающими жидкостями – расплавленным парафином. Парафин в воде не растворяется, и поэтому промытый после фиксации кусочек ткани необходимо предварительно обезводить, и только затем пропитывать. [4]
Обезвоживание ткани производятся постепенно (чтобы не произошло сморщивания) путем проведения ее через спирты возрастающей крепости: 70º, 80º, 96º. Количество используемого спирта зависит от размеров кусочков и способа обезвоживания. В каждом спирте кусочки находятся от нескольких часов до 1 суток в зависимости от величины кусочка. Неконтролируемое, неполное обезвоживание может привести к недостаточному пропитыванию заливочными средами (парафином, целлоидином) и в этой связи, трудностям при изготовлении срезов. [5]
При заливке кусочки предварительно пропитываются теми жидкостями, которые служат растворителями для парафина (ксилол или толуол).
Парафиновая среда «Гистомикс», является готовым продуктом, который содержит в своем составе натуральный воск и синтетические полимерные добавки. Точкой плавления является 52ºС. «Гистомикс не требует дополнительной фильтрации и гомогенизации, а также добавления каких-либо модифицирующих веществ. Эта смесь качественно депарафинизируется, что позволяет сохранить морфологическую и антигенную структуру ткани. «Гистомикс» адаптирован для использования в автоматических системах проводки и заливки. «Гистомикс» дает возможность получать более плотные блоки, это особенно актуально при работе в условиях температуры окружающей среды 25-26ºС.
Одновременно лучше проводить кусочки одинакового размера и по возможности одинаковой плотности. Образцы меньших размеров или кусочки рыхлых, мягких тканей проводятся быстрее. [6]
Срезы с блоков изготовляются на микротоме. Микротом — специальное механическое устройство, предназначенное для приготовления гистологических срезов определенной толщины.
Наиболее распространены микротомы санный и замораживающий. В специальных устройствах микротома зажимается парафиновый блок и микротомный нож. Существует механизм, поднимающий объектодержатель с блоком на заданное количество микрометров. Это позволяет при каждом скольжении ножа в плоскости параллельной поверхности блока получать срезы толщиной 5-10 микрометров с парафиновых блоков.
Принцип работы санных микротомов заключается в том, что объект, помещенный на столик, перед каждым движением ножа автоматически поднимается на заданную высоту (толщину среза).
Современные санные микротомы имеют моторизированную систему подачи, систему ретракции, программируются, параметры настройки выводятся на цифровой дисплей.
Предпосылкой для получения хороших гистологических срезов служит правильный выбор угла наклона ножа и угла резания.
Под углом наклона понимают угол, образуемый нижней поверхностью ножа с плоскостью резания. Наилучшим считается такой угол наклона, при котором плоскость заточки ножа расположена параллельно верхней поверхности блока. Обычно он равен 13—15°. Если нож установлен так, что угол наклона больше оптимального, то срез будет крошиться, если меньше — резка невозможна, так как лезвие ножа будет лишь скользить по поверхности блока.
Под углом резания подразумевают угол между длинной осью ножа и воображаемой линией, идущей через центр блока параллельно движению салазок, несущих нож. Величина угла резания зависит от свойств обрабатываемого материала: чем он мягче, тем угол меньше, и, наоборот, чем тверже, тем угол больше. При косом расположении ножа уменьшается сопротивление его режущего края поверхности блока, что облегчает резку мягких блоков. Максимальный угол резания равен 90°, минимальный — 20—30°.
Способ приготовления гистологических срезов зависит от вида заливки и свойств самого материала.
Изготовленные на микротоме срезы окрашиваются. Перед окраской из парафиновых срезов обязательно удаляют парафин (растворением в ксилоле).
Окрашивание необходимо производить для того, чтобы отчетливо выявить под микроскопом тонкие структуры объекта. В неокрашенных срезах большинство структур одинаково преломляет свет, поэтому рассмотреть их не удается.
Выявление на срезе гистологических структур основано на неодинаковом их отношении к красителям. Одни структуры среза вступают в реакцию с кислыми красителями и ими окрашиваются (ацидофильные, оксифильные структуры), другие реагируют с основными красителями и окрашиваются преимущественно ими (базофильные структуры). Некоторые структуры окрашиваются и кислыми и основными красителями.
По происхождению различают краски естественные, к которым относятся краски растительного и животного происхождения, и краски искусственные. Краской растительного происхождения является гематоксилин, который добывается из кампешевого дерева, растущего в Америке и в Армении.
К краскам животного происхождения относится кармин, который добывается из насекомых кошенили, живущих на кактусовых деревьях в Мексике, Армении и др. В настоящее время большинство красок готовят синтетически (искусственные краски).
По окрашиванию определенных гистологических структур различают краски ядерные (окрашивание ядра), цитоплазматические (окрашивающие цитоплазму), и специальные, окрашивающие избирательно определенные структуры.
Ядерные краски – гематоксилин, кармин, сафранин, метиленовая синь, азур, тионин.
Цитоплазматические краски – эозин, пикрофуксин.
Чаще всего для окрашивания гистологических срезов применяется окрашивание раствором гематоксилина (приготовленным по методу Бемера) и 1-2% эозином. [7]
Самая распространенная в настоящее время окраска гематоксилилин-эозин, предполагает последовательно окрашивание ядерным (основным) красителем-гематоксилином, и цитоплазматическим (кислым)-эозином.
Гематоксилин окрашивает в сине-фиолетовые тона оболочку ядер клеток, хроматин. Эозин окрашивает в розово-красно-оранжевые тона цитоплазму и некоторые неклеточные структуры.
Гематоксилин представляет из себя эфирную вытяжку из кампешевого дерева, произрастающего в Америке.
Гематоксилин имеет вид бесцветных или буроватых кристаллов, хорошо растворимых в спирте. Красящими свойствами обладает продукт окисления гематоксилина- гематеин.
В настоящее время стали классическими гематоксилины Майера, Малори, Кораци, Эрлиха.
Достоинствами гематоксилин-эозина являются: избирательная окраска ядер, что дает возможность судить о способности ядер к окрашиванию; избирательная окраска цитоплазмы и цитоплазматических образований; относительная простота метода; возможность получения хороших результатов на материале фиксированном различными способами; прочность окраски (препараты могут храниться много лет).
Примерная схема окраски препаратов гематоксилин — эозином: парафиновые или замороженные срезы доводят до воды; окраска гематоксилином; промывка в воде; дифференцировка в спирте, подкисленном соляной кислотой; промывка в проточной воде; ополаскивание дистиллированной водой; окраска 1 % эозином; ополаскивание дистиллированной водой; обезвоживание в спирте; просветление в ксилоле; заключение среза – капля бальзама, покровное стекло.
Заменяющий окраску гематоксилин – эозином, является метод окраски по Ван – Гизону, который может рассматриваться как специальный, и как общий. В качестве ядерного красителя используют гематоксилин Вейгерта, цитоплазматического - пикрофуксин.
Позволяет окрашивать соединительную, мышечную ткань, дифференцировать коллагеновые волокна. Результат окраски: ядра клеток - черно-коричневые или фиолетовые; коллагеновые волокна - красно-черные; мышечная ткань, цитоплазма других клеток, клетки крови, кератин - желтые.
Окрашенные и промытые в воде срезы во избежание помутнения обезвоживают в спиртах (70º, 96º), просветляют в карбол-ксилоле, ксилоле, а затем на предметное стекло, где находится срез, помещают каплю канадского бальзама и срез накрывают покровным стеклом. Бальзам представляет собой растворенную в ксилоле смолу одного из видов сосны, растущей в Канаде (канадский бальзам), смолу пихты (сибирский бальзам) или специальную синтетическую среду.
Для приготовления гистологических и цитологических препаратов используется синтетическая монтирующая среда – БиоМаунт. В состав этой вязкой прозрачной жидкости входит смесь акриловых смол в ксилоле. Препарат от других заливочных сред отличается стабильностью при воздействии прямых солнечных лучей, высоких температур, влажности и УФ-лучей. [8]