Мутагенез
Обработанный мутагенами материал, по данным Н.А. Корнеева (1985), используется далее или для скрещивания, или для посадки, или для прививки, посева. Организуются наблюдения за опытными и контрольными растениями. Ведется журнал, где отмечаются все характеристики исходного материала.
Перспективные гаметические и соматические мутанты могут быть сразу отобраны в таких случаях, когда они поступают на сортоиспытание. Если же наряду с полезными мутанты несут отрицательные изменения, то их скрещивают с ценными видами или формами, или повторно обрабатывают мутагенами, а если уже производят отбор и испытания представляющих интерес мутантов.
Соматические мутации могут возникнуть не во всех клетках обрабатываемого растения, а только в некоторых из них. В этих случаях растения оказываются химерными. Как отмечает Н.А. Корнеев (1985), измененные клетки делятся медленнее нормальных, что приводит к постепенному вытеснению мутантных тканей нормальными. Это явление получило название соматического отбора. Для выявления скрытых соматических мутации применяются специальные приемы расхимеривания. У древесных видов расхимеривание можно провести путем одной или многократной посадки опытного растения на пень и последующего отбора мутантных порослевин, черенкование отдельных частей растения, прививки черенков и почек, микроклонального разложения.
Метод получения мутанта
Для получения мутанта ели кавказской, берут семена ели, предварительно замоченные в воде в течение суток, разделяют на четыре группы по 500 семян в каждой. Каждую группу семян помещают в марлевые мешочки и опускают в растворы этиленимина концентраций 0,05%; 0,1%; 0,5% и в воду на 1 час, затем семена промывают водой, подсушивают и высеивают в ящики с почвой.
Полиплоидия
В 20-х годах стало развиваться мутационная генетика - учение о возникновении мутаций, т.е. таких изменении признаков организмов, которые передаются по наследству. Мутации возникают в половых клетках.
Советский ученый Н.И. Вавилов установил, что у родственных растений возникают сходные мутационные изменения, например у пшеницы в окраске колоса, остистости. Эта закономерность объясняется сходным составом генов в хромосомах родственных видов. Открытие Н.И. Вавилова получило название закона гомологических рядов. На основании его можно предвидеть появление тех или иных изменений у культурных растений.
Изменчивость организмов - одно из важнейших проявлений жизни. В природе не существует двух совершенно сходных особей. Различия обусловленны наследственными и внешними факторами. Поэтому изменчивость организмов выражается в двух формах: наследственной и модификационной.
Внешний вид окружающих нас организмов - это результат сложного взаимодействия их наследственной основы и факторов окружающей среды. Каждое растение в разных условиях выглядит по-разному. Например, во влажный год у растений крупные, мясистые листья, а в засушливый - мелкие, тонкие. Если бы листья в сухих условиях оставались такими же крупными, избыточное испарение влаги привело бы к их гибели. Свойство организмов реагировать на изменение окружающей среды - названо нормой реакции.
Модификационная изменчивость играет огромную роль в сохранении и распространении вида. Эволюция происходит за счет наследственных изменений, мутаций и рекомбинаций наследственных факторов.
У одного и того же организма стабильность генов различна: один ген может мутировать в несколько раз чаще другого. Различия в мутабельности отмечены не только между разными генами, но и разными формами вида. Склонность к мутированию не одинакова и у разных видов. На частоту мутирования оказывают влияние физиологические и биохимические изменения, происходящие в клетке под влиянием внешних условий. Под действием некоторых внешних факторов количество мутаций увеличивается в сотни раз.
Мутации появляются в клетках любых тканей многоклетоточногоорганизма. Если они возникли в половых клетках, их называют генеративными, в клетках других тканей теласоматическими. Ценность мутации различна, она обусловлена типом размножения организма. Генеративные мутации проявляются у зародышей следующего поколения, а соматические - только у той особи, у которой они возникли, и по наследству другому поколению не передаются.
Разновидность соматических мутаций у растений - почковые мутации, появляющиеся в меристемных клетках точки роста стебля. Развившийся из этой клетки побег полностью имеет мутантный признак. Раньше эти мутации называли спорами. Из такого спорта, обнаруженного у сорта яблони Антоновка могилевская белая, И.В. Мичурин получил известный сорт Антоновка шестисотграммовая. Многие лучшие американские сорта яблони также были созданы использованием почковых мутаций. Целый ряд ценных сортов картофеля также происходит из спонтанно возникших форм с соматическими мутациями.
К мутациям принято относить разного рода генетические преобразования, связанные с ядром и цитоплазмой клетки. Причиной мутации могут быть химические изменения гена, мелкие и крупные перестройки хромосом, изменение числа хромосом, а также изменения органелл цитоплазмы. Отсюда название разных типов мутации. Генные или точковые мутации затрагивают изменения молекулярной структуры молекулы ДНК. Происходит замена или включение одной пары азотистых оснований, а также выпадении нескольких их пар. Результат действия генных мутаций - образование белка нового типа или отсутствие белка из-за препятствия его синтеза. Мутации, связанные с разрывами и перестройками хромосом, называют хромосомными.
Причиной возникновения мутаций в естественных условиях пока с полной достоверностью не установлены. Мутации, проводимые искусственным путем происходят за счет воздействия радиацией, действием химических веществ.
В 1892 году русский ботаник И.И. Герасимов исследовал влияние температуры на клетки зеленой водоросли спирогиры и обнаружил удивительное явление - изменение числа ядер в клетке. После воздействия низкой температурой или снотворным (хлороформом и хлоралгидратом) он наблюдал появление клеток без ядер, а также с двумя ядрами. Первые вскоре погибали, а клетки с двумя ядрами успешно делились. При подсчете хромосом оказалось, что их вдвое больше, чем в обычных клетках. Так было открыто наследственное изменение, связанное с мутацией генотипа, т.е. всего набора хромосом в клетке. Оно получило название полиплоидии, а организмы с увеличенным числом хромосом - полиплоидов. В природе хорошо отлажены механизмы, обеспечивающие сохранение постоянства генетического материала. Каждая материнская клетка при делении на две дочерние строго распределяет наследственное вещество поровну. При половом размножении новый организм образуется в результате слияния мужской и женской гаметы. Чтоб сохранилось постоянство хромосом у родителей и потомства, каждая гамета должна содержать половину числа хромосом обычной клетки. И в самом деле, происходит уменьшение в два раза числа хромосом, или, как назвали ученые редукционное деление клетки, при котором в каждую гамету попадает только одна из двух гомологичных хромосом. Итак, гамета содержит гаплоидный набор хромосом - т.е. по одной от каждой гомологичной пары. Все соматические клетки диплоидны. У них два набора хромосом, из которых один поступил от материнского организма, а другой от отцовского. Полиплоидия успешно используется в селекции.
Изучение некоторых разновидностей и сортов культивируемых древесных растений показало, что по своей генетической природе они являются аллополинлоидами древних гибридных видов. Между количеством хромосом и свойствами полиплоидных форм не всегда наблюдается прямая связь. Часто диплоидные особи оказываются значительно лучше полиплоидов, полученных от них. Например, тетраплоидные формы березы, тополей, вязов, ольхи и белой акации растут медленнее диплоидных, а триплоидные особи оказались более быстрорастущими. Например, триплоидная осина характеризуется необычайно крупными листьями и исключительно быстрым ростом. Разработаны методы массового искусственного получения триплоидной осины. Опыты показали, что лополиплоидия дает намного больше возможностей для селекции, чем аутополиплоидия.
Фертильность определяется порядком прохождения мейоза. У тетраплоидных особей в клетках растения существуют два набора гомологичных хромосом, которые в мейозе группируются по четыре хромосомы. Четыре гомологичные хромосомы из одной группы могут расходиться к противоположным полюсам следующим образом: 2и2;1иЗ; Зи1. Дочерние клетки в результате мейоза могут получить неполный или избыточный набор хромосом. Гаметы с несбалансированным набором хромосом, как правило, погибают. Таким образом, гаметы получают несбалансированные наборы хромосом и погибают. Такому стерильному дереву с нарушенным процессом образования гамет можно вернуть плодовитость (фертильность) и вмешательством в процесс формирования кариотипа зародыша семян. Это имеет большое значение при отдаленной гибридизации для восстановления фертильности в последующих поколениях ценных гибридов.
Существует правило: если диплоид фертильный, то образованный от него тетраплоид может быть стерильным; если же диплоид стерильный, то производный тетраплоид может быть фертильным. Наряду с этим замечено, что если в Р\ диплоидный гибрид стерилен или образует варьирующее потомство, то при удвоении числа хромосом он может стать фертильным и хорошо размножаться, так как в этом случае все члены одного набора хромосом полностью соответствуют своим двойникам в другом наборе хромосом. Например, полученный гибрид с диплоидным набором хромосом имеет негомологичные хромосомы вследствие скрещивания отдаленных в систематическом отношении видов. В результате хромосомы не образуют во время мейоза необходимых гомологичных пар и не распределяются равномерно по полюсам. Вместо этого они могут мигрировать к полюсам в сочетаниях 2и0; 1и1. В каждом случае яйцеклетка или пыльцевое зерно получает несбалансированные наборы хромосом и погибает. Однако если число хромосом этого гибрида удваивается и образующаяся тетраплоидная особь имеет два полных набора хромосом (по 2п в каждом), получаются гаметы с гомологичными наборами хромосом. В мейозе хромосомы образуют нормальные пары и равномерно распределяются в дочерние клетки. Такое тетраплоидное дерево становится фертильным. Следовательно, в селекционной работе с древесными растениями полиплоидия приобретает большое значение как метод восстановления фертильности преодоления явления несовместимости при отдаленной межвидовой гибридизации.
Расщепление у диплоидов может сильно отличаться от расщепления у полиплоидов, следовательно, и реакция на самоопыление у тетраплоидов и диплоидов может быть разной.
Зеленая революция». В течение последних 15—20 лет в ряде стран, в частности Индии, селекционеры добились резкого подъема продуктивности сельскохозяйственных культур, особенно зерновых. Это событие было названо «зеленой революцией». Индийский генетик М. С. Сваминатан создал сорта пшеницы на основе заранее разработанной программы скрещивания, включающей введение в местные сорта определенных генов. В первую очередь это были гены карликовости, обусловливающие резкое сокращение длины стебля. Короткостебельные неполегающие сорта получены путем гибридизации местных сортов с мексиканскими карликовыми пшеницами. Наряду с увеличением урожайности до 70—80 ц/га эти сорта отличались повышенным содержанием белка, а также ценной аминокислоты лизина. Общий сбор пшеницы в Индии за 20 лет (с начала 50-х годов до 1970г.) возрос почти в три раза (С.И.Алиханян, 1985).
Методы получения полиплоидов
Существующие методы искусственного получения аллополиплоидов можно разделить на две группы: опыление нередуцированными гаметами и индуцирование мутагенами. При нормально протекающем, мейозе хромосомное число в клетках уменьшается с 2п до 1п. Иногда редукционного деления не происходит, и образуются яйцеклетки или пыльцевые зерна с 2п хромосомами. Если пыльцевое зерно с 2п хромосомами оплодотворит яйцеклетку с гаплоидным набором хромосом, образуется триплоидный эмбрион. Таким образом, получают тетраплоидную осину, опыляя крупными триплоидными пыльцевыми зернами женские цветки диплоидных растений. Крупную триплоидную пыльцу отделяют от диплоидной, просеивая пыльцу через тонкую ткань.
Индуцирование полиплоидии в свою очередь проводится тремя способами:
1. Воздействие нагреванием, высушиванием или холодом. Удвоение соматических хромосом таким путем происходит довольно часто (в 1 % или более делящихся клеток). Образующиеся клетки с тетраплоидным набором хромосом обрастают вокруг тканью и растение в целом остается диплоидным.
2. Индуцирование колхицином и подофиллином. Они не препятствуют делению хромосом, а подавляют только механизм образования веретена деления, при помощи которого/разделившиеся хромосомы мигрируют к полюсам. Поэтому при воздействии этими веществами хромосомы делятся, но не расходятся к полюсам, и диплоидная клетка превращается в тетраплоидную. Колхицин используют в качестве мутагена чаще, чем подофиллин. Обычно его применяют в виде слабого (0,1— 0,5 %-ного) водного раствора в течение нескольких часов или дней. Колхицин влияет на любую активно растущую ткань, например на клетки кончика корня или прорастающее пыльцевое зерно. Обработка колхицином часто заканчивается образованием миксоплоидов, или «химер», имеющих и диплоидные, и тетраплоидные ткани. Миксоплоиды могут быть разных типов: одна ветвь тетраплоидная, другая—диплоидная, или верхушка листа диплоидная, а основание тетраплоидное. Если верхушка листа тетраплоидная, а основание диплоидное, то оно растет быстрее и лист заворачивается вверх, если наоборот, то лист заворачивается вниз.
3. Получение триплоидов из семян. Триплоидные растения древесных видов характеризуются быстрым ростом. Поэтому получение тетраплоидов для последующего перевода их в триплоиды скрещиванием с диплоидами становится распространенным направлением селекции на гетерозис. Так, в Северной Европе в больших количествах выращивают триплоидные деревья осины, которые получают в результате скрещивания женских клонов тетраплоидных растений с одним из диплоидных мужских клонов. Эту работу, как правило, проводят в теплицах. Дополнительно к этому практикуют посадку одного тетраплоидного клона в центре естественных насаждений мужских диплоидных особей. На деревьях женского клона семена будут триплоидными.
Гаплоидные особи образуются в результате самопроизвольного деления неоплодотворенной яйцеклетки. Такие формы обнаружены как у голосеменных, так и у покрытосеменных. Однако гаплоидные формы древесных пород в селекции не применяются, так как они нежизнеспособны.
Из неоплодотворенных яйцеклеток индуцируют развитие партеногенетических особей после опыления их заранее инактивированной пыльцой. Среду для культуры тканей обычно готовят из агара с добавлением веществ, стимулирующих рост: сахарозы, аминокислот, гормонов растений, минеральных веществ, экстрактов пыльников. Температурный режим и свет – важнейшие факторы при культуре тканей растений. Пыльцевые зерна в культуру тканей берут в период, когда генеративное и вегетативное ядра начинают одновременно делиться. При этом имеется большая вероятность образования триплоидных эмбрионов, чем гаплоидных.
Такие методы успешно используются при работе с травянистыми растениями. Это дает основание полагать, что эти методы можно будет применять и при работе с древесными породами (Корнеев,1985).
Метод получения полиплоида
Для получения полиплоида ели кавказской, берут семена ели и проращивают на фильтровальной бумаге в чашечках Петри диаметром 6 см, разложив их по периметру чашки. При достижении приростками длины;-6 см, эту чашку помещают в другую чашку Петри большего диаметра (10см), в которую наливают растворы колхицина разных концентраций: 0,5; 1и 2,0%. Проростки пригибают таким образом, чтобы семядоли и конус нарастания находились в растворах колхицина. Через несколько дней их вынимают и прополаскивают в воде. Из некоторых проростков готовят временные препараты, используя точки роста проростков, подсчитывают число хромосом и устанавливают наиболее эффективные растворы колхицина с целью получения полиплоидов.
Генная инженерия
Один из важнейших путей изучения культурных растений в будущем, занимается генная инженерия. Она направлена на создание новых форм и сортов растений с наследственно закрепленными хозяйственно ценными признаками. Методы генной инженерии обеспечивают высокую точность передачи признаков, в результате сроки получения новых форм и сортов сокращаются.
Использование бактериальных генов открывает нетрадиционные пути повышения устойчивости растений к пестицидам, повреждению насекомыми и заморозкам. Появляется возможность увеличения продуктивности. Датой начала генно-инженерных работ по лесной селекции следует считать 1984 год. Когда в США было впервые осуществлена генетическая трансформация сосны (Колесниченко, 1999).
Особенно актуально применение методов генетической инженерии к древесным породам, для которых полученные растения с новым признаком традиционными методами селекции требуют несколько десятков лет. Выполнение гибридного анализа, при работе ДНК древесных растений связано с определенными трудностями. В частности очень большой размер, генного ряда вида хвойных растений.
В данное время, когда в арсенале генной инженерии уже имеются ряды генетических конструкций, кодирующих такие важные хозяйственные признаки, такие устойчивость к болезням и повреждению насекомыми. На первый план выдвигаются разработка методов генетической трансформации растений, где должны удовлетворяться следующие требования: стабильная интеграция чужеродной ДНК в гене без его нарушения, экспрессия чужеродного гена, высокий выход трансформированных клеток и тканей, возможность регенерации растений из трансформированных тканей. Существует ряд методов генетической трансформации растений, основанных как на использовании природных векторных систем Ti и Riплазмид агробактерий. ДНК растительных вирусов так и на прямом введении генетических конструкций в клетки растений.
В данное время методы генетической трамсформации растений по средством Ti(Ri) плазмиды агробактерий применяются очень широко.
Генно-инженерые работы включают две главные группы методов:
1) Инокумирование растений культурной агробактерий и по - культивирование эксплантов или протопластов с культурной агробактерий. Эти методы основаны на природном способе инфицирования растения агробактериями. В этом случае эффективность трансформации в значительной мере определяется способностью использования трансформировать данный вид растения.
2) Методы по культивированию позволяют получить большое количество трансформированных клеток и тканей в строго регулирующих условиях. В отличие от методов инокулирования данные методы требуют регулярного контроля.
Методы прямого переноса ДНК в растение. В работе с этим методом необходимо добиться иммобилизации клеток, для чего применяют следующие способы: закреплении клеток в агаре; обработка стеклянной поверхности полиплоидами; использовать присасывающей пипетки. В отличие от других методов прямого переноса ДНК путем микроиньекций возможен перенос целых хромосом.
Инъекции ДНК в молодые цветоносные побеги. Этот метод связан с предыдущими, но в отличие от него перенос ДНК производится не в протопласте или клетки, а в целые растения.
Для введения ДНК в клетки растений используют полиэтиленгликоль и повиниловый спирт. Эти вещества при высоких значениях рН и наличии ионов Са индуцируют протопласты к поглощению чужеродной ДНК.
3) Электропорирование.
Применялось для введения «химерного» гена хлорофениколацетилтрансферозы в протопласты, ряда двудольных и однодольных растений.
Высокоскоростной микроснаряд для переноса ДНК основан на способности молекулярных титановых и вольфрамовых частиц с напыленной на них ДНК на большой скорости через мембрану и проникать в клетку не вызывать её гибель. Перенос ДНК липосомами. Слияние липосом с протопластами стимулирует с полиэтиленглкжолем. После слияния такой липосомы с протопластами получали регенерацию трансформированных растений (Колесниченко, 1999).
Предлагается трансформация ДНК. Есть 2 главных этапа генетической трансформации: 1) введение ДНК в ядра клеток, подлежащих трансформации, с включением ее в хромосомы, без нарушений нормальной генной экспрессии; 2) интродуцированная ДНК переваривается клеткой или интегрируется в хромосомах. В последнем случае происходит стабильная генетическая трансформация, и интродуцированная ДНК передается последующим генерациям во время формирования гамет. Но трансформированные клетки должны регенерироваться во всем дереве, и это достигается за счет культуры invitro. Деревьям вводится ДНК генов, кодирующих антимикробные пептиды. Получено несколько линий хвойных, устойчивых к болезням, возбуждаемым Cronartiumribicola.
Размещено на Allbest.ru