Лекция 5
Тема: Иммунодиагностика
1. Иммунодиагностика
2. Серологические реакции: РА, РП, РСК, РИФ, ИФА, РИА, ИБ.
Иммунодиагностика
Иммунные реакции, основанные на взаимодействии антигена с антителом, являются основой диагностических исследований. Реакция между антигеном и антителом состоит из специфической и неспецифической фазы. В специфическую фазу происходит быстрое специфическое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Неспецифическая фаза – более медленная, проявляется видимыми физическими явлениями (образ. хлопьев или преципитата в виде помутнения); фаза требует определенных условий (рН среды, электролитов).
Иммунные реакции используют при диагностических и иммунных исследованиях у больных и здоровых людей. Применяют серологические методы (от лат.serum-сыворотка), т.е. методы изучения антител и антигенов с помощью реакций антиген-антитело, определяемых в сыворотке крови и др. жидкостях, а также в тканях организма.
Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов возбудителя позволяет поставить диагноз болезни.
Серологические реакции применяют также для идентификации антигенов микробов, различных б. а. в., групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепторов клеток и др.
Идентификацию возбудителя проводят путем изучения антигенных св-в с помощью диагност. сывороток, т.е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические антитела. Это т.н. серологическая идентификация микроорганизмов.
В микробиологии и иммунологии применяют реакции агглютинации, преципитации, нейтрализации, с участием комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (РИА, ИФА, ИФМ). Все эти реакции различаются, но все они основаны на взаимодействии антигена с антителом и применяются для выявления, как антител, так и антигенов. Иммунные реакции высокочувствительны и высокоспецифичны.
1. Реакция агглютинации
РА (от лат. склеивание) – происходит связывание антителами корпускулярных антигенов
(бакт., эритр.и др.клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных агрегатов). Реакция протекает при наличии электролитов (изот. р-р NaCl – 0.85%).
Варианты: развернутая, ориентировочная, непрямая и др. Образуются хлопья или осадок (клетки, склеенные антителами, имеют 2 или более антигенсвязывающих центра) (стр.284, рис.13.1).
РА используют для:
1). определения антител в сыворотке крови больного, например, при бруцеллезе (р.Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (р.Видаля) и др.инф.бол.;
2). определения возбудителя, выделенного от больного;
3). определения групп крови с использованием моноклональных антител против аллогенов эритроцитов.
Развернутая РА – для определения у больного антител: к разведениям сыворотки крови больного добавляют диагностикум (взвесь убитых микробов) и через несколько часов инкубации при 370 С отмечают наиб. разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т.е. образуется осадок.
Характер и скорость агглютинации зависят от вида антигена и антител.
Реакция агглютинации с О – диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостаб. О – антиген) происходит медленнее в виде мелкозернистой агглютинации.
Реакция агглютинации с Н – диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие термолабильный жгутиковый Н – антиген) – крупнохлопчатая и протекает быстрее.
Ориентировочная РА – для определения возбудителя от больного применяют диагн. антитела (агглют. сыворотку), т.е. проводят серотипирование возбудителя. Ставят реакцию на предметном стекле: к капле диагностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют ч.к. возбудителя, выделенного от больного (контроль – вместо сыворотки капля
р – ра хлорида). В капле с сывороткой и микробами появляется хлопьевидный осадок.
Развернутая РА (при положительной реакции на стекле) ставится в пробирках с разведениями агглютинирующей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя. Реакцию считают (+), если агглютинация отмечается в разведении, близком к титру диагностической сыворотки. В контроле – нет осадка, равномерная муть.
РНГА, РПГА – реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации – основана на использовании эритроцитов с адсорбированными на их поверхности антигенами или антителами (стр.285, рис.13.2). РОНГА – для обнаружения ботулин. токсина.
Реакция коагглютинации. Клетки возбудителя опр.с помощью стаф., предварительно обработанных иммунной диагн. сывороткой. Стафилококки, содержащие белок А, имеют сродство к Fс – фрагменту иммуноглобулинов, неспецифически адсорбируют антимикробные антитела, которые взаимодействуют активными центрами с микробами, выделенными от больных. Образуются хлопья, состоящие из стаф., антител диагнос. сыворотки и определяемого микроба.
РТГА – основана на блокаде, подавлении антигенов вирусов антителами иммунной сыворотки, вирусы теряют способность агглютинировать эритроциты (рис. 13.3.). прим.для диагностики вирусных инфекций (грипп, корь, краснуха, клещевой энцефалит и др.).
РА – для определения групп крови системы АВО и резус – фактора.
РА – для определения антирезусных неполных антител (непрямая реакция Кумбса) при внутрисосудистом гемолизе.
Реакции преципитации
РП – это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах.
РП ставят в пробирках – реакция кольцепреципитации, в гелях, питательных средах и др. разновидности: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез, реакция флоккуляции (по Рамону) (рис.13.5.,13.6.,13.7) – появление опалесценции или хлопьевидной массы при реакции токсин – антитоксин или анатоксин- антитоксин.
1.3.Реакции с участием комплемента – основаны на активации комплемента комплексом антиген - антитело.
РСК – при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fс – фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т.е. происходит связывание комплемента комплексом антиген-антитело. Если не образуется комплекс, то комплемент остается свободным. РСК проводят в две фазы: 1 фаза – инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2 фаза (индикаторная) – выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1 фазе происходит связывание комплемента комплексом антиген – антитело, и тогда во 2 фазе не происходит гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов; реакция (+). При несоответствии антигена или антитела (в исслед. образце нет антигена или антитела) комплемент остается свободным и во 2 фазе присоединится к комплексу эритроцит – антиэритроцитарное антитело, произойдет гемолиз; реакция (-). (рис.13.8.).
РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней (р-ция Вассермана при сифилисе).
Р-ция радиального гемолиза – РРГ – ставят в лунках геля из агара, содержащего эритроциты барана и комплемент. В лунки вносят гемол. сыворотку с антителами против эритроцитов барана, вокруг лунок образуется зона гемолиза. Так определяют активность комплемента и гемолитической сыворотки, а также антитела в сыворотке крови у больных гриппом, краснухой, клещевым энцефалитом. На эритроцитах адсорбируют антигены вируса, а в лунки геля, содержащего данные эритроциты, добавляют сыворотку крови больного. Противовирусные антитела взаимодействуют с вирусными антигенами, адсорбированными на эритроцитах, после чего к этому комплексу присоединяется комплемент, вызывая гемолиз.
Р-ция иммунного прилипания – РИП – основана на активации комплемента корпускулярными антигенами (бактериями, вирусами), обработанными иммунной сывороткой. Образуется активированный третий компонент комплемента (С3b), кот. присоединяется к корпускулярному антигену в составе иммунного комплекса.
На эритроцитах, тромбоцитах, макрофагах имеются рецепторы для С3b, благодаря чему при смешивании этих клеток с иммунными комплексами, несущими С3b, происходит их соединение и агглютинация.
1 .4. Реакция нейтрализации
Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов, их токсинов.
РН – проводят путем введения смеси антиген – антитело животным или в чувствительные тест – объекты (к-ру клеток, эмбрионы). При отсутствии повреждающего действия говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки, т.е. о специфичности взаимодействия комплекса антиген – антитело(рис.13.9, стр. 290).
Р-ции с использованием меченых антител или антигенов.
РИФ (метод Кунса)
Различают прямой, непрямой, с комплементом – три разновидности метода.
Реакция Кунса является методом экресс-диагностики для выявления антигенов микробов или антител.
Прямой метод РИФ – антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, светятся в УФ – лучах люминисцентного микроскопа в виде каймы.
Непрямой метод РИФ – комплекс антиген – антитело выявляется с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагн. сыворотки. Несвязавшиеся антитела отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образ. комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромами. Наблюдают в люминисцентном микроскопе (рис.13.10, стр.290).
ИФА
Выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, коньюгированных с ферментом – меткой (пероксидазой хрена, бета – галатозидазой или щелочной фосфатазой).
После соединения антигена с меченной ферментом имм. сывороткой в смесь добавляют субстрат – хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, и изменяется цвет продукта реакции – интенсивность окраски прямо пропорциональна кол-ву связавшихся молекул антигена и антител.
Твердофазный ИФА – наиболее распространен. вариант ИФА, когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе (н., в лунках планшеток из полистерола).
При определении антител в лунки с антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, и субстрат (хромоген) для фермента. После каждого добавления лунки промывают.
При положительном результате изменяется цвет р-ра хромогена. Твердофазный носитель можно сенсибилизировать и антителами. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку, меченную ферментом и субстрат для фермента.
Конкурентный вариант ИФА: искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Другой тест – искомые антитела и меченные антитела конкурируют друг с другом за антигены.
ИФА применяют для диагн. вирус., бакт.и паразитарных болезней (гепатит В, ВИЧ и др). Опред. гормоны, ферменты, лекарства и др.б.а.в. в минорных концентрациях – 10-10: 10-12 г/л.
РИА
В реакции антиген – антитело применяют меченные радионуклиды. После взаимодействия отделяют радиоактивный иммунный комплекс и опред. его радиоактивность в счетчике: интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.
Варианты РИА: твердофазный вариант РИА и конкурентный РИА.
Метод экологически опасен.
РИА применяют для определения антигенов микробов, иммуноглобулинов, б.а.в. в минорных количествах.
1.8. Иммуноблоттинг – высокочувствительный метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА.
Антиген выделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят его (блот – пятно) из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА.
Фирмы выпускают полоски с блотами антигенов, на которые наносят сыворотку больного. После инкубации отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс антиген + антитело больного + антитело против Ig человека выявляют добавлением субстрата хромогена, изменяющего окраску под действием фермента (рис.13.13., стр.292).