ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ.
НАУЧНО – ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЕ АСПЕКТЫ.
Генная инженерия — экспериментальная наука. Возникла на стыке молекулярной биологии и генетики официально в 1972 г., когда в лаборатории П. Берга (Стенфордский университет, США) была получена первая рекомбинантная (гибридная) ДНК на базе объединения генетического материала, полный геном вируса обезьян 40, часть генома измерного бактериофага и гены галактозного оперона.
Генная инженерия нацелена на создание организмов с новыми комбинациями наследственных свойств путем конструирования функционально-активных генетических структур в форме рекомбинантных ДНК из фрагментов геномов разных организмов, которые вводились в клетку.
Как отмечалось, впервые рекомбинантную ДНК получила группа П. Берга в 1972 г.
В 1973-74 гг. С. Коэном, Д. Хелинским, Г. Бойером и другими учеными впервые сконструированы функционально активные молекулы гибридной ДНК, то есть удалось их клонирование. Были созданы первые, не существующие в Природе, плазмиды (стабилизатор наследства) на базе ДНК из разных видов бактерий и высших организмов, из ДНК лягушки (кодирующей синтез рРНК), морского ежа (контролирующей синтез белков-гистон), и от мыши.
Вскоре аналогичная работа была выполнена в нашей стране группой специалистов под руководством С. И. Алиханяна и А. А. Баева.
Достижения генетики и химии нуклеиновых кислот позволили разработать методологию генной инженерии:
—открытие явления рестрикции — модификации ДНК и выделение ферментов рестриктаз для получения специфических ферментов;
—создание методов химического и ферментативного синтеза генов;
—выявление векторных молекул ДНК, способных перенести в клетку чужеродную ДНК и обеспечить там экспрессию соответствующих генов;
— разработка методов трансформации у различных организмов и отбор клонов, несущих рекомбинантные ДНК.
Составляющие методики.
Явление рестрикции — модификации ДНК впервые наблюдали Г. Бертани и Д. Ж. Вейгль, а его суть раскрыл В. Арберг: в бактериях действуют специальные ферменты, способные специфично распознать "свою" (бактериальную) ДНК от "чужой" (фаговой). Эти ферменты ограничивают возможность размножения фаговой ДНК в бактериях путем ее специфичной (в зависимости от типа фермента) деградации. Такие ферменты были названы эндонуклеазами рестрикции няирестриктазами.
В 1971 г. группой Г. Смитга была выделена первая рестриктаза, специфично расщепляющая двухцепочную ДНК в строго определенных сайтах. Вскоре было установлено, что болынинство видов бактерий обладает специфичными системами рестрикции — модификации.
В генной инженерии используют ферменты, разрывающие двухцепочную ДНК в зоне участка узнавания или на незначительном фиксированном расстоянии от него. Фермент распознает специфичную последовательность и разрезает ее. В последнем случае образуются выступающие одноцепочечные концы, получившие название "липких". В настоящее время известно несколько сотен таких рестриктаз, что обеспечивает возможность получения различных фрагментов ДНК, содержащих желаемые гены.
Работы в направлении синтеза гена начались еще до 1972 г.
Так в 1969 г. появились публикации по выделению генов при помощи физических и генетических методов.
На начальном этапе развития генной инженерии широко использовался способ получения генов из природных источников, и он до сих пор применяется для создания банка генов.
В том же году группой Корани впервые осуществлен химический синтез расшифрованного гена аланиновой тРНК дрожжей, но функционально не активный; позднее и активный ген супрессорный тирозиновой тРНК, галактозного оперона.
Этому способствовало совершенствование методов определения первичных структур (секвенирования) нуклеиновых кислот, а также белков и других продуктов, кодируемых синтезированным геном.
Секвенирование ДНК играет большую роль и в изучении функций генов и генетических систем.
Метод химического синтеза генов и введения их в клетки микроорганизмов обеспечил возможность получения продуцентов инсулина человека для лечения больных диабетом, открылся путь для производства продуктов белковой природы.
Широкое распространение нашел метод ферментативного синтеза генов по механизму обратной транскрипции. Не вдаваясь в его суть, отметим, что он позволяет синтезировать практически любой ген в присутствии соответствующих иРНК, методы выделения которых достаточно хорошо разработаны.
С его помощью созданы и клонированы в бактериях гены, кодирующие глобины человека, животных, птиц и т. п., интерферон человека, который используют для борьбы с вирусными инфекциями, злокачественными опухолями и рядом других заболеваний.
Однако остается нерешенной проблема стабильности гибридных молекул. Вектор должен обеспечивать стабильное наследование рекомбинантных ДНК в автономном, реже интегрированном с хромосомой состоянии, иметь генетические маркеры для обнаружения трансформированных клеток, содержать сайт узнавания и др. Он используется для получения банка генов, так как клонированные в них большие фрагменты ДНК легко хранить, выделять и анализировать. Создаются специальные векторы и для клонирования рекомбинантных ДНК в клетках животных и растений, при этом в клетках животных ими могут быть некоторые вирусы, а растений — агробактерии на основе специальных плазмид и передаваться клеткам в естественных условиях бактериями.
Схема, используемая в генной инженерии, едина:
1. Обработка кольцевой векторной молекулы рестриктазой с образованием линейной формы ДНК.
2. Формирование гибридной структуры путем слияния ее с фрагментом чужеродной ДНК.
3. Введение гибрида в клетку реципиента.
4. Отбор клонов трансформированных клеток на селективных средах.
5. Доказательство присутствия рекомбинантной ДНК в этих клонах путем ее выделения из клеток, обработки соответствующими рестриктазами и анализа образовавшихся фрагментов методом электрофореза.
Известно несколько методов объединения фрагментов ДНК из разных источников, позволяющих включить клонируемую донорную ДНК в состав вектора.
Одним из перспективных методов клеточной инженерии в культуре клеток человека, животного и растения является гибридизация соматических клеток (Б. Эфрусси и Г. Барски).
В культивируемые клетки млекопитающих или развивающиеся эмбрионы ДНК вводят методом микроинъекции ДНК в ядро с помощью микроманипулятора.
Развитие методов микрохирургии клеток позволило заменять ядра оплодотворенных яйцеклеток на ядра из соматических клеток и в результате получать организм, идентичный тому, чье ядро было перенесено в яйцеклетку.
Создание гибридов высших растений возможно путем слияния протопластов и соматической гибридизации растительных клеток.
Все эти методы могут использоваться для конструирования новых форм микроорганизмов, животных и растений, несущих гены, детерминирующие желаемые признаки.
Не менее важна генная инженерия как аппарат фундаментальных исследований.
Потенциальные возможности генной инженерии в действительности очень велики, и они будут реализовываться.
ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.
Эмбриогенез — это феноменальный процесс, при котором информация, заложенная в линейной структуре ДНК, реализуется в трехмерный организм.
ДНК представляет запись последовательности аминокислот для построения молекул различных белков. В эмбриональном развитии в разное время появляются разные белки. Существуют гены-регуляторы, которые определяют время и скорость синтеза. Установлены состав и структура гена, но неизвестно как кодируется форма организма и, соответственно, как линейные спирали цепочной структуры белков соединяются в объемные структуры.
Клонирование есть воспроизведение живого существа из его неполовых клеток. Это попытка прорыва сквозь запреты Природы.
Клонирование органов и тканей — это задача номер один в области трансплантологии, травматологии и др. областях медицины и биологии.
При пересадке клонированных органов не возникает реакции отторжения и возможных последствий (например, рака, развивающегося на фоне иммунодефицита). Клонированные органы — это спасение для людей, попавших в автомобильные аварии или иные катастрофы, а также нуждающихся в радикальной помощи из-за каких-либо заболеваний.
Клонирование может дать возможность бездетным людям иметь своих собственных детей, поможет людям, страдающим тяжелыми генетическими заболеваниями. Так, если гены, определяющие какую-либо подобную болезнь, содержатся в хромосомах отца, то в яйцеклетку матери пересаживается ядро ее собственной соматической клетки, тогда появится ребенок, лишенный опасных генов, точная копия матери. Если эти гены содержатся в хромосомах матери, то в ее яйцеклетку будет перемещено ядро соматической клетки отца — появится здоровый ребенок, копия отца.
Более скромная, но не менее важная задача клонирования — регуляция пола сельскохозяйственных животных, а также клонирование в них человеческих генов "терапевтических белков", которые используются для лечения людей, например гемофиликов, у которых мутировал ген, кодирующий белок, участвующий в процессе свертывания крови. Это тем более важно, поскольку гемофилики считаются "группой риска" по СПИДу.
Бум, связанный с рождением овечки Долли, это всего лишь эпизод развитии клонирования. Когда она подрастет и обзаведется своим потомством, в ее молоке будет и человеческий белок, отличающийся от овечьего. Она станет на службу человечеству.
Американские ученые несколько модифицировали метод шотландцев, использовав ядра эмбриональных (зародышевых) фибробластов — взятых у взрослого организма клеток. Это облегчило задачу введения "чужого" гена, поскольку в культуре фибробластов это делать значительно легче и дешевле.
А, кроме того, так был обойден теломерасный (теломерас — бессмертие гена) запрет и смягчен запрет на клонирование (не распространяется на животных, отдельные органы и ткани, а клонирование людей отодвигается на 10 лет).
Это сулит уникальные перспективы для человечества, несмотря на все высказанные политическими, религиозными, научными и общественными деятелями морально-этические и чисто биологические возражения по использованию клонирования.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ:
Естествознание затрагивает широкий спектр вопросов о многочисленных и всесторонних проявлениях свойств Природы.
В 70-е годы XX века создана техника выделения гена из ДНК, а также методика размножения нужного гена. В результате этого возникла генная инженерия. Внедрение в живой организм чужеродной генетической информации и приемы, заставляющие организм эту информацию реализовывать, составляют одно из самых перспективных направлений в развитии биотехнологии. Методами генетической инженерии удалось получить интерферон и инсулин. Объектом биотехнологии выступает сегодня не только отдельный ген, но и клетка в целом.
Клеточная инженерия открывает широкие возможности практического использования биомассы культивируемых клеток и создания на их основе промышленных технологий, например, для быстрого клонального микроразмножения и оздоровления растений.
Применение методов клеточной инженерии позволяет существенно интенсифицировать процесс создания новых форм организмов. Метод гибридизации соматических клеток — новый метод, дающий возможность получать межвидовые гибриды, т.е. преодолевать естественный барьер межвидовой нескрещиваемости, чего нельзя было достичь традиционными методами селекции. Для этого в искусственно созданных условиях выделяют и сливают протопласты - клетки, лишенные стенок, — обоих родительских растений и получают гибридные клетки, которые могут затем регенерировать целое гибридное растение с признаками обоих родителей. Это позволяет получать совершенно новые организмы, не существовавшие в природе. Но при этом возникает опасность, что искусственно созданные организмы могут вызвать непредсказуемые и необратимые последствия для всего живого на Земле, в том числе, и для человека.
Генная и клеточная инженерия обратили внимание человечества на необходимость общественного контроля за всем, что происходит в науке.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Горелов А.А. Концепции современного естествознания. – М.: Центр, 1997.
2. Денисов С.Ф., Дмитриева Л.М. Естественные и технические науки в мире культуры. – Омск: Изд-во ОмГТУ, 1997.
3. Жигалов Ю.И. Концепции современного естествознания – М.: Гелиос АРВ, 2002
4. Идеи и наш мир: Великие концепции прошлого и настоящего / Под ред. Р. Стюарта. – М.: ББМ АО, ТЕРРА – книжный клуб, 1998.
5. Карпенков С.Х. Концепции современного естествознания: Учебник для вузов. – М.: Культура и спорт, ЮНИТИ, 1997. – 400 с.
6. Масленникова И.С., Шапошникова Т.А., Дыбов А.М. Концепции современного естествознания: Учеб. пособие / СПбГИЭА. – СПб., 1998.
7. Солопов Е. Ф. Концепции современного естествознания. – М.: ВЛАДОС, 2001
8. Фолта Я. Н. История естествознания в датах. – М.: Прогресс, 1987.
ПРИЛОЖЕНИЕ:
ХРОНОЛОГИЯ КЛОНИРОВАНИЯ
1883 год — открытие яйцеклетки немецким цитологом Оскаром Гертвигом (1849 -1922).
1943 год — журнал "Сайенс" сообщил об успешном оплодотворении яйцеклетки в "пробирке".
1953 год — Р. Бриге и Т. Кинг сообщили об успешной разработке метода "нуклеотрансфера" - переноса ядра клетки в гигантские икринки африканской шпорцевой лягушки.
1973 год — профессор Л. Шетлз из Колумбийского университета в Нью-Йорке заявил, что он готов произвести на свет первого "бэби из пробирки", после чего последовали категорические запреты Ватикана и пресвитерианской церкви США.
1977 год — закончилась публикация серии статей о работах профессора зоологии Оксфордского университета Дж. Гердона, в ходе которых было клонировано более полусотни лягушек. Из их икринок удалялись ядра, после чего в оставшийся "цитоплазматический мешок" пересаживалось ядро соматической клетки. Впервые в истории науки на место гаплоидного ядра яйцеклетки с одинарным набором хромосом было внесено диплоидное ядро соматической клетки с двойным набором.
1978 год — рождение в Англии Луизой Браун первого ребенка "из пробирки".
1981 год — Шетлз получает три клонированных эмбриона (зародыша) человека, но приостанавливает их развитие.
1982 год — Карл Илмензее из Женевского университета и его коллега Питер Хоппе из лаборатории Джексона в Бар-Харборе, штат Мэн, в которой с 1925 года разводят мышей, получили серых мышат, перенеся ядра клеток серого зародыша в цитоплазму яйцеклеток, полученных от черной самки, после чего эмбрионы были перенесены в белых самок, которые и выносили потомство. Результаты не были воспроизведены в других лабораториях, и Илмензее обвинили в фальсификации.
1985 год — 4 января в одной из клиник северного Лондона родилась девочка у миссис Котгон — первой в мире суррогатной матери, не являющейся биологической матерью (то есть "бэби Котгон", как назвали девочку, была зачата не из ее яйцеклетки). Был вынесен парламентский запрет на эксперименты с человеческими эмбрионами старше четырнадцати дней.
1987 год — специалисты Университета имени Дж. Вашингтона, использовавшие специальный фермент, сумели разделить клетки человеческого зародыша и клонировать их до стадии тридцати двух клеток (бластомеров), после чего зародыши были уничтожены. Тогдашняя американская администрация пригрозила лишать лаборатории дотаций из федеральных фондов, если в них будут проводиться подобные опыты.
1996 год — 7 марта журнал "Нейчер" помещает первую статью коллектива авторов из института Рослин в Эдинбурге, в которой сообщили о рождении пяти ягнят, полученных без участия барана: в цитоплазматические мешки яйцеклеток были перенесены ядра культуры эмбриональных клеток, полученных от другого зародыша. Администрация Билла Клинтона еще раз подтверждает свое намерение лишать поддержки федеральных фондов всех, кто вознамерится экспериментировать с человеческими эмбрионами; так, был лишен субсидий исследователь из университета Вашингтона, осуществлявший анализ пола зародыша и анализ дефектных генов на стадии восьми клеток.
1997 год — 27 февраля "Нейчер" поместил на своей обложке на фоне микрофотографии яйцеклетки знаменитую овечку Долли, родившуюся в том же институте Рослин в Эдинбурге. В конце июня Клинтон направил в Конгресс законопроект, запрещающий "создавать человеческое существо путем клонирования и ядерного переноса соматических клеток".
1997 год — в самом конце декабря журнал "Сайенс" сообщил о рождении шести овец, полученных по рослинскому методу. Три из них, в том числе и овечка Долли, несли человеческий ген "фактора IX", или кровоостанавливающего белка, который необходим людям, страдающим гемофилией, то есть несвертываемостью крови.
1998 год — чикагский физик Ричард Сид объявляет о создании лаборатории по клонированию людей: он утверждает, что от клиентов у него не будет отбоя.
1998 год — начало марта — французские ученые объявили о рождении клонированной телки.
1999год — конец года— Англия разрешила проведение работ по клонированию человеческих органов для создания банка заменителей.