Лабораторна работа
Тема: Барбитураты. Химико-токсикологический анализ.
Цель: Сформировать навыки проведения химико-токсикологического анализа производных пиримидин-2,4,б-триона (барбитуратов): ознакомиться с методами изолирования, очистки извлечений и обнаружения.
Оборудование:
1. Пипетки 1, 2, 5 мл
2. Пробирки
3. Резиновые груши
4. Делительная воронка
5. Стеклянные палочки
6. Спиртовая горелка
7. Капилляры
8. Хроматографическая пластинка “Cилуфол”
9. Хроматографическая камера
10. Предметное стекло
11. Микроскоп
Реактивы:
1. 1% спиртового раствора ацетата кобальта Co(CH3COO)3
2. 25% раствора аммиака NH3 . H2O
3. Концентрированная серная кислота H2SO4
4. Раствор хлорцинкйода
5. Подкисленный спиртовой раствор йодида калия KI
6. Смесь растворов хлорида железа (III) и йодида калия FeCl3 + KI
7. Меднопиридиновый реактив
8. Раствор сульфата ртути(II), НgSO4, 5%-ный
9. Раствор дифенилкарбазона (ДФК), 0,02%-ный
10. Хроматографическая система хлороформ – н — бутанол – 25%-ный раствор аммиака (70: 40: 5).
Объекты анализа:
- трупный материал (внутренние органы);
- биологические жидкости (кровь, моча);
- лекарственные препараты.
Ход работы
Изолирование
10 мл мочи в делительной воронке подкисляют 2 М раствором кислоты соляной до рН 2, трижды экстрагируют хлороформом по 10 мл. Хлороформные фазы отделяют и объединяют, фильтруя через безводный натрия сульфат. Органический растворитель удаляют в токе теплого воздуха.
Хроматографическая очистка и обнаружение
Остаток растворяют в небольшом объеме (0,1-0,2 мл) хлороформа и количественно с помощью капилляра переносят на стартовую линию хроматографической пластинки “Cилуфол”.
На расстоянии 2 см от анализируемой пробы в одну точку (диаметр не более 0,5 мл) последовательно вносят по 0,02 мл спиртовых растворов (1 мг/мл) барбитала, фенобарбитала и этаминала-натрия.
Пятна подсушивают, хроматографирование проводят в системе хлороформ – н — бутанол – 25%-ный раствор аммиака (70: 40: 5). Камера предварительно насыщается системой растворителей в течение 20 минут.
Длина пробега растворителей 10 см. После подсушивания при комнатной температуре или в токе теплого воздуха до полного удаления растворителей, пластинки опрыскивают соответствующими реагентами.
Реагенты, используемые для проявления пластинки:
- Раствор сульфата ртути(II), НgSO4, 5%-ный раствор.
- Раствор дифенилкарбазона (ДФК), 0,02%-ный раствор (следует избегать избытка дифенилкарбазона).
Барбитураты обнаруживают в виде сине-фиолетовых или красных пятен на исчезающем сиреневом фоне.
Химический анализ
Для анализа используют хлороформный (эфирный) экстракт, полученный из водной вытяжки из объекта при рН=2.
Химический метод основан на применении реакций комплексообразования и микрокристаллоскопических реакций.
Опыт 1. Реакция с аммиачным раствором нитрата кобальта
К части остатка после испарения хлороформного (эфирного) экстракта, помещенного в фарфоровую чашку, добавляют с помощью стеклянной палочки смесь из 1% спиртового раствора ацетата кобальта и 25% раствора аммиака в соотношении 1:1. При наличии в остатке производных барбитуровой кислоты появляется красно-фиолетовое окрашивание.
Опыт 2. Реакция обнаружения кислотной формы барбитуратов
На предметное стекло наслаивают экстракт путем его последовательного испарения. Полученный сухой остаток растворяют в капле концентрированной серной кислоты. Рядом наносят 1 каплю воды очищенной, после чего обе капли осторожно соединяют с помощью тонкой стеклянной палочки. Через 10-20 мин (иногда через 60 мин и даже через 3 сут.) при хранении стекла во влажной камере наблюдают образование кристаллического осадка (под микроскопом) с характерной для каждого барбитурата формой кристаллов.
Барбитал кристаллизуется в виде бесцветных прозрачных прямоугольных призм. Фенобарбитал образует сфероиды и сростки в виде «снопов», «ежей», состоящих из тонких бесцветных игольчатых кристаллов. Барбамил образует прозрачные шестиугольные пластинки и длинные призмы, группирующиеся в сфероиды. Этаминал кристаллизуется в виде характерных сростков из призматических кристаллов. Бутобарбитал образует осадок, состоящий из прозрачных призм и сростков из них.
Опыт 3. Реакция с хлорцинкйодом
На предметное стекло наносят экстракт и испаряют досуха. К сухому остатку прибавляют 1 каплю раствора хлорцинкйода. Стекло помещают во влажную камеру. Через 10-15 мин наблюдают под микроскопом характерную форму образовавшихся кристаллов.
С хлорцинкйодом этаминал образует сростки из окрашенных в коричневый или оранжево-коричневый цвет призматических кристаллов. Барбитал образует прямоугольные пластинки темно-красного, зеленого, фиолетового, серо-розового цветов. Барбамил образует пластинки, окрашенные в красный, оранжевый цвет, или сростки из них. Бутобарбитал образует сростки из кристаллов в виде темно-коричневых ромбов. Фенобарбитал с хлорцинкйодом кристаллов не образует.