В растениях обычно содержится несколько близких по строению и свойствам гликозидов, разделение и идентификация которых до настоящего времени представляют собой сложную и не всегда разрешимую задачу.
Анализ сырья складывается из нескольких стадий: экстракция сапонинов из сырья, очистка полученного извлечения, разделение на индивидуальные компоненты. Экстрагируют сапонины из сырья обычно полярными растворителями: метанолом и этанолом различной концентрации, водой, 0,9%-ным раствором натрия хлорида. Иногда сырье перед экстракцией обрабатывают петролейным эфиром, четыреххлористым углеродом, диэтиловым эфиром для разрушения нерастворимых в полярных растворителях комплексов сапонинов со стеринами, белками, фенольными соединениями. Очистку полученных извлечений проводят различными способами, что зависит от структуры сапонинов. Полярные сапонины плохо растворимы в этиловом и метиловом спиртах, выпадают в осадок при охлаждении, длительном стоянии спиртового экстракта или при добавлении этанола. Гликозиды с небольшой углеводной цепочкой обычно плохо растворимы в воде и выпадают в осадок при разбавлении спиртовых экстрактов водой. Кислые тритерпеновые сапонины растворимы в водных растворах щелочей и выпадают в осадок при подкислении. Также из спиртовых растворов тритерпеновые сапонины можно осаждать диэтиловым эфиром, ацетоном, этилацетатом, иногда бутиловым и изоамиловым спиртами. Полученную сумму сапонинов очищают повторным переосаждением от полярных сопутствующих веществ: моно- и олигосахаридов, фенольных соединений, органических кислот и др.
Ряд методов основан на способности сапонинов образовывать нерастворимые в воде или водном спирте соли с гидроксидом бария или ацетатом свинца и комплексы с холестерином, танинами, белками. Затем эти соли или комплексы разлагают.
Эти методы позволяют получить более чистую сумму сапонинов.
Качественный анализ
1. Реакция гемолиза. Готовят извлечение на изотоническом растворе натрия хлорида 1: 30 настаиванием на кипящей водяной бане в течение 30 минут. К 2 мл извлечения добавляют 2 мл 2% взвеси дефибринированной крови. В присутствии сапонинов образуется прозрачный красный раствор ("лаковая кровь").
2. Реакция пенообразования. Водное извлечение из сырья (1: 10) встряхивают в пробирке в течение 15 сек. Не исчезающая в течение 15 мин пена говорит о возможном присутствии сапонинов.
3. Хроматография в тонком слое. Водное или спиртовое извлечение хроматографируют на силикагеле или алюминия оксиде в подходящей системе растворителей. Для нейтральных сапонинов чаще всего используют н-бутанол – уксусная кислота – вода, для кислых – н-бутанол – водный аммиак в различных соотношениях. Систему подбирают экспериментально. На хроматограммах сапонины обнароуживают, проявляя различными кислотными реагентами: конц. Кислота серная, уксусный ангидрид, 25% раствор фосфорномолибденовой кислоты, треххлористая сурьма и др., часто в сочетании с кобальта хлоридом, ванилином, пара-диметиламинобензальдегидом и др.
Тритерпеновые сапонины проявляются в виде красновато- или буроватофиолетовых пятен.
Стероидные сапонины при проявлении хроматограмм 1% раствором сурьмы треххлористой, конц. кислотой серной и уксусным ангидридом образуют желтые (спиростановые) пятна (реакция Санье). В настоящее время хроматографический метод дает наиболее достоверное представление о наличии сапонинов в сырье.
4. Реакция Лафона. К 2 мл спиртового извлечения добавляют 1 мл кислоты серной концентрированной, 1 мл этанола и 1 каплю 10 % раствора железа сульфата. В присутствии сапонинов образуется сине-зеленое окрашивание.
5. При добавлении к 2 мл водного извлечения 1 мл 10% раствора натрия нитрата и 1 капли кислоты серной концентрированной образуется кроваво-красное окрашивание.
6. При добавлении к 2 мл спиртового извлечения 1 % раствора холестерина образуется белый осадок.
Количественное определение
Единого точного метода количественного определения сапонинов в сырье нет, ввиду их разнообразного строения.
1. Ранее использовали гравиметрический метод, основанный на физических свойствах сапонинов: разной растворимости гликозидов и агликонов. Сапонины из сырья экстрагируют метиловым или этиловым спиртом в аппарате Сокслета. Экстракт упаривают под вакуумом, сапонины осаждают органическим растворителем; отфильтровывают, промывают, высушивают до постоянной массы и взвешивают. Результаты получаются завышенные, так как кроме сапонинов осаждаются сопутствующие вещества. Более точные результаты могут быть получены, если провести гидролиз суммы сапонинов, отделить агликоны, высушить и взвесить.
2. В настоящее время для определения суммы сапонинов и индивидуальных веществ используют физико-химические методы (спектрофотометрия, колориметрия), основанные на способности сапонинов при нагревании давать окрашенные продукты с кислотными реагентами. Например, при определении суммы сапонинов каштана конского, синюхи голубой используют кобальта хлорид с кислотой серной концентрированной; женьшеня – ванилин с кислотой серной концентрированной, стероидных сапонинов – п-диметил-аминобензальдегид в 4 моль/л растворе кислоты хлористоводородной. Калибровочные графики строят по стандартному образцу (например, эсцину) или кобальта хлориду. Эти методы часто используют в сочетании с предварительным хроматографическим разделением суммы сапонинов. Для кислых сапонинов (например, аралозиды) используют потенциометрическое титрование после предварительного гидролиза сапонинов. Иногда для сырья, содержащего сапонины (при научных исследованиях) определяют пенное число и гемолитический индекс.
Пенное число – наименьшая концентрация извлечения из 1 г сырья, при встряхивании которого в течение 15 сек образуется устойчивая в течение 15 мин пена. Основан на физических свойствах сапонинов.
Гемолитический индекс – наименьшая концентрация извлечения из 1 г сырья или раствора чистого сапонина, которая вызывает гемолиз эритроцитов, содержащихся в 1 мл 2 % раствора дефибринированной крови барана. Извлечение сапонинов и разведение проводят изотоническим раствором. Готовится серия разведений и определяется наименьшая концентрация. При работе с кровью других животных параллельно ставят контроль со стандартным сапонином (0,02 % раствор дигитонина). Результаты выражают соотношением массы сырья (1 г) и разведения. Например 1:5000, 1:20000 и т.д.
Эти методы не дают представления о количественном (%) содержании сапонинов, а свидетельствуют о поверхностной или гемолитической активности.