Биосенсоры - это аналитические устройства, использующие биологические материалы для «узнавания» определенных молекул и выдающие информацию об их присутствии и количестве в виде электрического сигнала. Принцип анализа, реализуемый в биосенсорах, основан на том, что биоматериал (ферменты, клетки, органеллы, иммунокомпоненты), иммобилизованный на физических датчиках, при взаимодействии с анализируемыми соединениями генерирует зависимый от концентрации сигнал, регистрируемый преобразователем.
Идея создания такого рода устройств возникла сравнительно недавно, в 60-х годах XX века. Впервые ее высказали Кларк и Лионе в 1967 г. Идея Кларка состояла в использовании ферментного электрода, т.е. электрохимического датчика с иммобилизованным на его поверхности ферментом. Затем в обиход вошло понятие «биосенсор» или «биочип». Это важное событие к науке. Здесь отражаются глубокие причины, связанные с так называемыми интеграционно-синтетическими процессами в науке, приводящими к появлению новых знаний.
Большинство биосенсоров ориентированы на анализ биологических жидкостей. Действительно, например, в крови находятся тысячи различных соединений. Задача заключается в том, чтобы быстро и эффективно (количественно) определить концентрацию нужного соединения, например, глюкозы. Для людей, страдающих диабетом, это жизненно важный клинический анализ. Биосенсоры обеспечивают такую возможность.
Функционально биосенсоры сопоставимы с датчиками живого организма — биорецепторами, способными преобразовывать все типы сигналов, поступающих из окружающей среды, в электрические. Наибольшее распространение сейчас получили биосенсоры на основе ферментов, Среди таких устройств различают субстратные и ингибиторные биосенсоры. С их помощью решают различные медико-биологические задачи (например, определение сахара в крови) и контролируют состояние среды обитания (контроль содержания токсикантов). Чувствительность ингибиторных биосенсоров чрезвычайно высока, например, возможно определение остаточных количеств некоторых пестицидов на уровне 0.01 мкг/л и меньше.
Принципы конструирования биосенсоров. Конструктивно любой биосенсор представляет комбинированное устройство, состоящее из двух принципиальных функциональных элементов: биохимического и физического, находящихся в тесном контакте друг с другом. Биохимический элемент представляет собой биоселектирующую структуру и выполняет функцию биологического элемента распознавания. В качестве бкохимического преобразователя используют все типы биологических структур: ферменты, антитела, рецепторы, нуклеиновые кислоты и даже живые клетки. Физический преобразователь сигнала, называемый трансдьюсер, преобразует определяемый компонент, а точнее, концентрационный сигнал, в электрический. Для считывания и записи информации используют электронные системы усиления и регистрации сигнала.
Трансдьюсерами могут быть электрохимические преобразователи (электроды), различного рода оптические преобразователи, гравитационные, калориметрические, резонансные системы. Все виды биоселектирующих элементов можно комбинировать с
различными трансдьюсерами. Это создает большое разнообразие различных типов биосенсоров.
Основными характеристиками, позволяющими биосенсорному анализу успешно конкурировать с традиционными методами, являются оперативность анализа, высокая специфичность и чувствительность при низкой стоимости, отсутствие необходимости использовать дорогостоящую аппаратуру и квалифицированный персонал.
Наличие в устройстве биоматериала с уникальными свойствами позволяет с высокой селективностью определять нужные соединения в сложной по составу смеси, не прибегая ни к каким Дополнительным операциям, связанным с использованием других реагентов, концентрированием и т.д. (отсюда и название безреагентные методы анализа). Существует большое разнообразие физических преобразователей: электрохимические (электроды), спектроскопические (оптроды), пьезоэлектрические и т.д.
Разработка биосенсоров относится к наукоемким технологиям и представляет одну из ветвей современной биотехнологии. В настоящее время существует несколько типов биосенсоров. Наибольшее развитие получили ферментные и клеточные биосенсоры. Например, ферментные электроды, ферментные микрокалориметрические датчики, биодатчики на основе хеми— и биолюминесценции.
Ферментные (или безреагентные) электроды – используют электрохимический способ определения веществ, образующихся в ходе ферментативного превращения. Представляют собой электрод с нанесенным поверхностным слоем (каким-либо природным полимером), содержащим один или несколько иммобилизованных ферментов (иногда фермент может находиться в растворимом состоянии в приэлектродном слое, окруженном мембраной). В зависимости от типа взятого за основу электрода подразделяются на потенциометрические и амперометрические.
Ферментные микрокалориметрические датчики - используют тепловой эффект ферментативной реакции. Состоит из двух колонок (измерительной и контрольной), заполненных носителем с иммобилизованным ферментом и снаряженных термисто-рами. При пропускании через измерительную колонку анализируемого образца происходит химическая реакция, которая сопровождается регистрируемым тепловым эффектом. Данный тип датчиков интересен своей универсальностью.
Хеми- и биолюминесцентные датчики — регистрируется световое излучение с различной длиной волны, испускаемое продуктами ферментативной реакции, находящимися в возбужденном состоянии. Конструкция включает колонку с иммобилизованными на носителе ферментами (люциферазой, пероксидазой) и светоприемное устройство. Заложенный в систему этого типа датчиков аналитический метод характеризуется, прежде всего, крайне высокой чувствительностью — позволяет определять фем-томольные (10-12М) количества вещества.
Клеточные биосенсоры. Одно из достижений биотехнологии связано с развитием методов включения живых клеток в полимеры и твердые носители различной природы, и применение такого рода материалов для решения задач медицины, управляемого биосинтеза, анализа. Иммобилизованные клетки обладают рядом удивительных свойств.
Клетки являются доступным биологическим материалом. Используют клетки растений, животных, человека, ко наибольшее применение нашли клетки микроорганизмов, которые культивируются, легко воспроизводятся и поддерживаются в чистой культуре. В отличие от ферментов при использовании клеток не требуется дорогостоящих стадий очистки.
Имеющиеся методы иммобилизации: позволяют получить клетки, сохраняющие около 100% активности ферментов и способные функционировать достаточно длительные промежутки времени. Клетки сохраняют все наиболее важные структуры и проявляют большую стабильность. В некоторых случаях клетки сохраняют жизнеспособность и активность ферментных систем в течение нескольких лет.
Клетки сохраняют, как правило, все системы жизнеобеспечения. Это позволяет проводить сложные последовательные реакции, осуществляя многостадийные процессы.
Для многих типов клеток, особенно микробных, разработаны эффективные методы генетических операций, дающие возможность получать мутанты с высоким содержанием того или иного белка или фермента, что дает возможность оперировать с высокоэффективными каталитическими системами. Поскольку клетки сохраняют аппарат биосинтеза белка, потенциально могут быть разработаны высокоэффективные методы генодиагностики. Основными недостатками этих биосенсоров являются медленный отклик электрода, связанный с необходимостью использовать толстые мембраны, а также сравнительно низкая селективность, обусловленная присутствием в клетке или тканях нескольких ферментных систем.
Для создания клеточных биосенсоров используют различные физические трансдьюсеры: электрохимические (амперометриче-ские, потенциометрические), оптические, акустические, калориметрические. Развитие получили биосенсоры с использованием техники LAPS (светоадресуемых потенциометрических сенсоров). На основе LAPS-системы созданы достаточно чувствительные системы слежения за физиологическим состоянием отдельных клеток - так называемые микрофизиометры.
Для создания биосенсоров используют микроорганизмы: Neyrospora europea - для определения аммиака, Trichosporon brassicae - для определения уксусной кислоты, Sarcina flava — для определения глутамина, Azoiobacier vineiaudii — для определения нитратов и другие. В тканевых электродах используют срезы почек и печени свиньи, срезы желтой тыквы, банана и другие. На основе гриба Aspergilus niger группой японских ученых были созданы биосенсоры для определения биогенных аминов в мясных продуктах.
Для иммобилизации клеток с сохранением их активности первоначально использовали материалы природного происхождения: желатину, агар, альгинат кальция, каррагенан. В последние годы разработаны и развиты методы включения живых клеток в синтетические полимерные гели. Особенно интересные и перспективные результаты получены с использованием так называемого метода криоиммобилизации клеток. Процедура крио-иммобилизации состоит из стадии получения суспензии клеток: в растворе полимера, замораживания суспензии с получением криоструктурированных гелей, размораживания с образованием пористого, механически прочного материала, устойчивого до температур 70-80°С. Клетки, включенные в такого рода пористый материал, сохраняют активность и способны функционировать в течение нескольких месяцев.