Определение содержания жирорастворимых
Витаминов А, D2, D3, E в овощных и фруктовых соках
Выполнил студент 4 курса 41 группы Факультета естествознания
Байрамов Ресул Рахманбердиевич
Минск 2017
Введение
Важнейшим классом незаменимых пищевых веществ являются витамины. Витамины представляют собой биологически активные органические соединения разнообразной химической природы. Недостаток, как и избыток, витаминов в организме одинаково вредны, так как вызывают глубокие нарушения различных функций организма, что приводит к тяжелым заболеваниям. В настоящее время ассортимент витаминных лекарственных средств представлен достаточно широко. Состав их сложен и многообразен. Жирорастворимые витамины (ЖРВ) применяются как самостоятельные препараты, а также являются важнейшими минорными компонентами лекарственного растительного сырья (ЛРС) и растительных масел на их основе. Анализ литературных источников свидетельствует об уникальном комплексе биологически активных веществ (БАВ), содержащихся в ЛРС, среди которых важную роль занимают каротиноиды, в частности β-каротин. Совместное присутствие таких ЖРВ, как К, Е, D и провитамина А обеспечивает возникновение синергизма лечебного эффекта. Синтетические аналоги этих витаминов не могут сравниться с их высокоактивными нативными формами, присутствующими в ЛРС. Известны способы идентификации, разделения и количественного определения ЖРВ в субстанции, одно- и многокомпонентных лекарственных формах, премиксах, биологически активных добавках, культурах микроорганизмов методом ВЭЖХ. Недостатком ВЭЖХ является нехватка квалифицированных кадров, дорогостоящего оборудования, реактивов и материалов, а также стандартных образцов. Нашли широкое применение также спектральные методы анализа. Фотоэлектроколориметрия, основанная на измерении оптической плотности растворов исследуемых витаминов после добавления каких-либо цветореагентов, образующих окрашенные продукты реакции. Прямая и дифференциальная спектрофотометрия находят широкое применение в анализе субстанций для контроля подлинности, степени чистоты и количественного содержания. Недостатками указанных спектральных способов являются: громоздкость и длительность определений, нестабильность окрашенных продуктов цветных реакций, недостаточная чувствительность и селективность, невозможность определения витаминов Е, D2 и β-каротина при совместном присутствии без предварительного разделения. Известно большое количество гостированных методик определения витаминов: титриметрические, спектрофотометрические, хроматографические, и другие, однако каждый из этих методов анализа имеет ряд недостатков. Высокоэффективная жидкостная хроматография является одним из наиболее распространенных методов определения жирорастворимых витаминов, благодаря возможности одновременно разделять и определять компоненты сложных по составу смесей. В связи с появлением большого количества витаминизированных продуктов питания, а также проблемой фальсификации лекарственных средств, возникает необходимость контроля за содержанием витаминов.
Витаминами (vita – жизнь) называют низкомолекулярные органические соединения, необходимые для нормальной жизнедеятельности организмов и выполняющие каталитические и регуляторные функции. Нарушение процессов обмена и развитие различных патологий (гиповитаминозы) часто связаны с недостаточным поступлением в организм, нарушением транспорта или изменениями синтеза коферментов с их участием. В качестве средства для предотвращения их дефицита в организме популярны фруктовые и овощные свежевыжатые соки.
Витамины занимают особое место среди биологически активных веществ таких, как антибиотики, гормоны, гликозиды и другие, поскольку активно участвуют в обмене веществ и каталитических процессах, повышающих защитную функцию организма. Избыток или недостаток водо- или жирорастворимых витаминов в организме человека может негативно влиять на его здоровье.
Глава 1. Определение жирорастворимых витаминов в фруктовых соках.
Способ определения жирорастворимых витаминов а, d2, е и в-каротина при совместном присутствии методом тонкослойной хроматографии.
Изобретение относится к способам стандартизации лекарственных препаратов, биологически активных добавок, премиксов, лекарственного растительного сырья, растительных масел, масляных экстрактов, изделий пищевой, химической и косметологической отраслей промышленности по содержанию основных жирорастворимых витаминов и может быть использовано в фармацевтической, химической, косметологической и пищевой отраслях промышленности для определения подлинности и степени чистоты жирорастворимых витаминов A, D2, E и β-каротина при совместном присутствии в одно- и многокомпонентных препаратах. Способ определения жирорастворимых витаминов A, D2, E и β-каротина при совместном присутствии включает выделение жирорастворимых витаминов из субстанции экстракцией 96%-ным этанолом, отделение спиртового экстракта витаминов с помощью делительной воронки, последовательное хроматографирование с использованием силикагелевых пластинок марки «Sorbfil» ПТСХ-П-А на полимерной подложке при участии двух элюентов с различной величиной пробега, время насыщения камеры парами элюента - 20 мин, время элюирования - 55 мин; высушивание при температуре не менее 80°C пластин в термостате в течение 3-5 мин, обработку пластины проявителем - 5%-ным спиртовым раствором кислоты фосфорномолибденовой, согласно изобретению в качестве элюентов использованы гексан:хлороформ (19:1) и гексан:хлороформ (3:1), а детектирование хроматографической зоны β-каротина проводят до обработки пластины проявителем при дневном свете. Способ обеспечивает упрощение и ускорение процесса определения жирорастворимых витаминов. 10 ил., 3 пр.
Изобретение относится к способам стандартизации лекарственных препаратов, биологически активных добавок, премиксов, лекарственного растительного сырья, растительных масел, масляных экстрактов, изделий пищевой, химической и косметологической отраслей промышленности по содержанию основных жирорастворимых витаминов и может быть использовано в фармацевтической, химической, косметологической и пищевой отраслях промышленности для определения подлинности и степени чистоты жирорастворимых витаминов A, D2, E и β-каротина при совместном присутствии в одно- и многокомпонентных препаратах.
Известны способы идентификации, разделения и количественного определения жирорастворимых витаминов в субстанции, одно- и многокомпонентных лекарственных формах, премиксах, биологически активных добавках, культурах микроорганизмов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Недостатком ВЭЖХ является нехватка квалифицированных кадров, дорогостоящего оборудования, реактивов и материалов, а также стандартных образцов. Одним из главных недостатков при определении витаминов с помощью ВЭЖХ остается подготовка образца для количественного определения, занимающая часто до 90% затрат времени анализа. В известных методах определения жирорастворимых витаминов методом ВЭЖХ подготовка образца к анализу остается такой же, как и в физико-химических методах, включая щелочной гидролиз или обработку раствора препарата диметилсульфоксидом при нагревании, четырехкратную экстракцию эфиром или гексаном, промывку водой, сушку натрием сернокислым, отгонку экстракта до сухого остатка и растворение его в соответствующем растворителе для получения необходимой концентрации для проведения анализа. Все эти операции значительно затрудняют и удлиняют время проведения анализа, снижают его точность [Козлов Э.И., Солунина И.А., Любарева М.Л., Надточий М.А., Хим. - фарм. журн., №10, Том 37, 50-53 (2003)].
Нашли широкое применение также спектральные методы анализа, такие как фотоэлектроколориметрия, прямая и дифференциальная спектрофотометрия, основанные на измерении оптической плотности исследуемых растворов после добавления каких-либо цветореагентов [Мелентьева Г.А. Фармацевтическая химия некоторых природных веществ с сильным биологическим действием, Изд-во мед. института им. И.М. Сеченова, Москва (1984), сс. 48-56; Экспериментальная витаминология, под ред. Ю.М. Островского, «Наука и техника», Минск (1979), сс. 80-129; «Раствор Ретинола ацетата в масле 33000 ME в капсулах». ФС 42-7811-97; Государственная фармакопея XI изд. Медицина, Москва (1990), Вып. 2; Государственная фармакопея СССР, 10-е изд., Медицина, Москва (1968); Государственная фармакопея Российской Федерации XII изд. - Часть 1. - М.: Изд-во: Научный центр экспертизы средств медицинского назначения, 2008. - 704 с.; ФС 42-2798-99. Таблетки «Глутамевит», покрытые оболочкой; ГОСТ 30417-98. «Растительные масла. Методы определения массовых долей витаминов А и Е», сс. 102-109; «Эргокальциферол раствор в масле 0,5%». ФСП 42-0008018000; ВФС 42-3128-98. «Драже бета-каротина 0,0025»].
Недостатками указанных спектральных способов являются: громоздкость и длительность определений, нестабильность окрашенных продуктов цветных реакций, недостаточная чувствительность и селективность, невозможность определения витаминов A, E, D2 и β-каротина при совместном присутствии, а также большие ошибки определения.
Известно использование тонкослойной хроматографии (ТСХ), которая, обладая всеми преимуществами хроматографических методов, находит широкое применение ввиду своей экспрессности, доступности, достаточной чувствительности, селективности, малой стоимости и простоты выполнения анализа [Ю. Кирхнер. Тонкослойная хроматография. Мир, Москва (1981), сс. 402-407; М. Шаршунова, В. Шварц, Ч. Михалец. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии. Мир, Москва (1980), Т. 2, с. 610; Гейсс Ф. Основы тонкослойной хроматографии. Мир, Москва (1999), 405 с.; О.Б. Рудаков, И.А. Востров, С.В. Федоров и др. Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии. «Водолей», Воронеж (2004), 528 с.].
Известен способ определения витамина Е и β-каротина в плодах облепихи методом ТСХ [Биологически активные вещества лекарственных растений / Георгиевский В.П., Комисаренко Н.Ф., Дмитрук С.Е. // Новосиб.: Наука, 1990. 333 с.; Богачева Н.Г., Кокушкина Н.П., Сокольская Т.А. Стандартизация лекарственного сырья облепихи крушиновидной, Фармация. 2001. №1. С.27-29], согласно которому точную навеску высушенных плодов 2-5 г растирают в сухой ступке с 10% раствором КОН в 96%-ном этаноле, переносят в колбу, добавляя 100 мг пирогаллола, ставят на 1 ч на горячую водяную баню при 80°C; экстрагируют токоферолы и каротиноиды петролейным эфиром; извлечение повторяют 4-5 раз; промытую эфирную фракцию обезвоживают прокаленным сернокислым натрием до получения прозрачного раствора, после чего петролейный эфир отгоняют в роторном вакуум-испарителе при температуре 40°C и разрежении 600-650 мм рт.ст.; сухой остаток растворяют в 3-5 мл бензола; бензольный раствор используют для хроматографирования; пластинку делят на две части, на левую половину наносят полоской 1-2 мл бензольного раствора неомыляемых веществ облепихи, на правую - бензольный раствор α-токоферола, растворитель - хлороформ, разделение веществ производят в темноте; продолжительность хроматографирования около 2 часов; левую половину каждой пластинки закрывают бумагой, а правую опрыскивают 0,5%-ным спиртовым раствором o-фенантролина и 0,2%-ным спиртовым раствором хлорного железа.
Недостатком известных способов определения жирорастворимых витаминов при совместном присутствии методом ТСХ является длительность процесса в связи с проведением нескольких аналитических процедур - идентификация витаминов проводится в различных хроматографических системах с использованием различных проявителей по отдельности, что значительно увеличивает время анализа, а также затраты на реактивы и материалы.
В методе фронтальной ТСХ применяется двукратное элюирование одной хроматографической пластинки в разных по составу подвижных фазах с разной величиной пробега элюентов, таким образом, на хроматограмме получают две или более (в зависимости от количества использованных систем) линий фронта растворителя [Карцова Л.А. Совместное определение водо- и жирорастворимых витаминов высокоэффективной тонкослойной хроматографией с использованием водно-мицеллярной подвижной фазы / Л.А. Карцова, О.А. Королева // Журн. Аналитической химии. - 2007. - Т. 62. - №3. - с.281-286].
В научной фармацевтической и медицинской литературе способов, позволяющих идентифицировать и количественно определять жирорастворимые витамины при совместном присутствии методом фронтальной ТСХ, не выявлено.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа определения подлинности, степени чистоты и количественного содержания жирорастворимых витаминов A, D2, E и β-каротина при совместном присутствии в сложных смесях за одну аналитическую процедуру методом фронтальной ТСХ.
Технический результат заключается в упрощении и ускорении процесса определения жирорастворимых витаминов в лекарственных препаратах, лекарственном растительном сырье при совместном присутствии с достаточной чувствительностью.
Технический результат достигается тем, что в способе определения жирорастворимых витаминов A, D2, E и β-каротина при совместном присутствии методом тонкослойной хроматографии, включающем выделение жирорастворимых витаминов из субстанции экстракцией 96%-ным этанолом, отделение спиртового экстракта витаминов с помощью делительной воронки, последовательное хроматографирование с использованием силикагелевых пластинок марки «Sorbfil» ПТСХ-П-А на полимерной подложке при участии двух элюентов с различной величиной пробега, время насыщения камеры парами элюента - 20 мин, время элюирования - 55 мин; высушивание при температуре не менее 80°C пластин в термостате в течение 3-5 мин, обработку пластины проявителем - 5% спиртовым раствором кислоты фосфорномолибденовой, согласно изобретению в качестве элюентов использованы гексан:хлороформ (19:1) и гексан:хлороформ (3:1), а детектирование хроматографической зоны β-каротина проводят до обработки пластины проявителем при дневном свете.
Оптимальный объем пробы - 10 мкл спиртового раствора β-каротина с содержанием 1 мг/мл, по 0,5 мкл спиртовых растворов витаминов A, E и D2 с содержанием 1 мг/мл, 10 мг/мл и 0,035 мг/мл соответственно.
Для выбора оптимальных условий хроматографического разделения эргокальциферола (витамин D2), β-каротина, ретинола ацетата (витамин Е) и токоферола ацетата (витамин А) было исследовано влияние полярности элюентов на хроматографическую подвижность витаминов в тонком слое. В эксперименте изучено более десяти типов элюирующих систем с различными значениями полярности. Для каждой элюирующей системы рассчитаны полярность P` по известной методике [Гейсс Ф. Основы тонкослойной хроматографии. Мир, Москва (1999), 405 с.; О.Б. Рудаков, И.А. Востров, С.В. Федоров и др. Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии. «Водолей», Воронеж (2004), 528 с.] и величина Rf (отношение расстояния, пройденного пятном, к расстоянию, пройденному растворителем). Как видно из данных, представленных на фиг.1 и фиг.2, для достижения оптимальных величин Rf β-каротина необходимо использовать элюенты с малыми значениями полярности P` (до 0,3 ед.). Тогда как витамины A, E и D2 при таких значениях полярности прочно удерживаются сорбентом, оставаясь на линии старта. Для них оптимальные величины Rf достигаются в системах гексан-хлороформ (5:1), гексан-хлороформ (4:1), гексан-хлороформ (3:1), когда полярность P` подвижной фазы находится в интервале 0,73-1,1. Это означает, что за одну процедуру хроматографирования разделить данные витамины не представляется возможным. Однако предлагаемый способ разделения и определения жирорастворимых витаминов A, D2, E и β-каротина при совместном присутствии с использованием фронтального элюирования позволяет решить данную задачу.
Был выбран интервал значений P` элюента, в котором данные зависимости приобретают линейный характер (от 0 до 0,2 ед. полярности системы для β-каротина; от 0,4 до 1,1 ед. для витамина Е (ретинола ацетата); от 0,58 до 1,47 ед. для эргокальциферола и от 0,7 до 1,5 для витамина А (токоферола ацетата)). Уравнения и коэффициенты корреляции приведены на фиг.3. С помощью предложенных зависимостей можно подбирать различные системы для разделения изучаемых жирорастворимых витаминов в тонком слое сорбента при совместном присутствии, чтобы величина Rf укладывалась в оптимальные значения. Таким образом, интервал полярностей P` элюента может варьировать в достаточно узком диапазоне от 0,05 до 0,168 ед. (для β-каротина); от 0,62 до 0,93 ед. (для витамина Е); от 0,76 до 1,07 ед. (для эргокальциферола) и от 0,95 до 1,26 (для витамина А) при совместном определении. Предлагаемый способ разделения жирорастворимых витаминов методом фронтальной ТСХ позволяет не только разделять смесь, но и достигать на хроматограммах оптимальных величин Rf.
Заявленный способ позволяет достичь четких зон округлой формы на хроматограммах жирорастворимых витаминов с оптимальным значением величины Rf, обеспечивает возможность разделения сложных смесей данных витаминов между собой и с другими биологически активными веществами.
Заявленный способ отличается достаточной чувствительностью (1·10-8 г для витамина А; 1·10-6 г для витамина Е; 7·10-9 г для витамина D2 и 1·10-5 г для β-каротина), что сопоставимо по чувствительности с определением данных витаминов на приборе ВЭЖХ, а также экономичностью, доступностью и экспрессностью.
Раздел 1.1 Примеры
Пример 1
Заявленный способ определения жирорастворимых витаминов был апробирован на витаминном лекарственном препарате «Аекол», содержащем витамины A, E и β-каротин (ФС 42-3182-95). Выделение жирорастворимых витаминов из препарата осуществляли методом реперколяции, который заключается в следующем: навеску препарата 1,26 г (точная навеска) делили на три части по 0,42 г. Первую порцию препарата обрабатывали 96%-ным этанолом в количестве 10 мл. Смесь энергично встряхивали в течение пяти минут, добиваясь тонкого эмульгирования масляного препарата в этаноле, а затем оставляли на сутки в прохладном, защищенном от света месте в плотно укупоренном виде. Спиртовой экстракт жирорастворимых витаминов отделяли с помощью делительной воронки. Каждую последующую порцию препарата экстрагировали вытяжкой, полученной из предыдущей. При этом максимально используется растворяющая способность экстрагента, так как слабые вытяжки имеют ее запас и могут извлекать действующие вещества из необработанного материала. Полученную суммарную вытяжку в количестве 3 мкл наносили на стартовую линию хроматографической пластинки и хроматографировали в системе №1 гексан-хлороформ (19:1) (пробег 8 см), а затем в системе №2 (пробег 6 см). Затем сначала проводили детектирование хроматографической зоны β-каротина при дневном свете, а потом пластину обработали проявителем - 5%-ным спиртовым раствором кислоты фосфорномолибденовой. Вид хроматограммы представлен на фиг. 4. Для каждой хроматографической зоны на хроматограмме были рассчитаны параметры хроматографического разделения: величина селективности сорбции (L) и коэффициент распределения (К). Параметры хроматографического разделения приведены на фиг.5. Результаты свидетельствуют об удовлетворительном разделении хроматографических зон на хроматограмме (так как критерием эффективного разделения является величина L>1) и правомерности использования данной методики.
Пример 2
Разработанный способ разделения и определения витаминов А и Е был апробирован на витаминном лекарственном препарате «Аевит» (ФС 42-1699-95). Так как заранее известно, что в препарате отсутствует каротин, то нет необходимости проводить фронтальное элюирование. Достаточно проводить определение в системе №2. «Аевит» содержит значительное количество изучаемых витаминов и они хорошо извлекаются при однократной экстракции. Поэтому содержимое одной капсулы растворяли в 10 мл 96%-ного этанола, хроматографировали в системе гексан-хлороформ (3:1), обрабатывали проявителем. Высота пробега растворителя - 9 см. Вид хроматограммы раствора «Аевит» и смеси стандартных образцов ретинола ацетата и токоферола ацетата представлен на фиг.6. Для каждой хроматографической зоны на хроматограмме были рассчитаны параметры хроматографического разделения: величина селективности сорбции (L) и коэффициент распределения (К). Параметры хроматографического разделения приведены на фиг.7. Результаты свидетельствуют об удовлетворительном разделении хроматографических зон на хроматограмме (так как критерием эффективного разделения является величина L>1) и правомерности использования данной методики.
Пример 3
Заявленный способ определения жирорастворимых витаминов был апробирован на растительном масле плодов облепихи, содержащем витамины D2, E и β-каротин (ФС 42-3873-99). Выделение витаминов из масла осуществляли методом реперколяции, как описано в примере 1. Навеску препарата 1,26 г (точная навеска) делили на три части по 0,42 г. Первую порцию масла обрабатывали 96%-ным этанолом в количестве 10 мл. Смесь энергично встряхивали в течение пяти минут, добиваясь тонкого эмульгирования масляного препарата в этаноле, а затем оставляли на сутки в прохладном, защищенном от света месте в плотно укупоренном виде. Спиртовой экстракт жирорастворимых витаминов отделяли с помощью делительной воронки. Каждую последующую порцию препарата экстрагировали вытяжкой, полученной из предыдущей. Полученную суммарную вытяжку из масла в количестве 5 мкл наносили на стартовую линию хроматографической пластинки и хроматографировали в системе №1 гексан-хлороформ (19:1) (пробег 8 см), а затем в системе №2 (пробег 6 см). Затем сначала проводят детектирование хроматографической зоны β-каротина при дневном свете, а потом пластину обрабатывают проявителем - 5%-ным спиртовым раствором кислоты фосфорномолибденовой. Вид хроматограммы представлен на фиг.8. Для каждой хроматографической зоны на хроматограмме были рассчитаны параметры хроматографического разделения: величина селективности сорбции (L) и коэффициент распределения (К). Параметры хроматографического разделения приведены на фиг.9. Результаты свидетельствуют об удовлетворительном разделении хроматографических зон на хроматограмме (так как критерием эффективного разделения является величина L>1) и правомерности использования данной методики.
Раздел 1.2 Вывод
Способ определения жирорастворимых витаминов A, D2, E и β-каротина при совместном присутствии методом тонкослойной хроматографии, включающий выделение жирорастворимых витаминов из субстанции экстракцией 96%-ным этанолом, отделение спиртового экстракта витаминов с помощью делительной воронки, последовательное хроматографирование с использованием силикагелевых пластинок марки «Sorbfil» ПТСХ-П-А на полимерной подложке при участии двух элюентов с различной величиной пробега, время насыщения камеры парами элюента - 20 мин, время элюирования - 55 мин; высушивание при температуре не менее 80°C пластин в термостате в течение 3-5 мин, обработку пластины проявителем - 5%-ным спиртовым раствором кислоты фосфорномолибденовой, отличающийся тем, что в качестве элюентов использованы гексан: хлороформ (19:1) и гексан: хлороформ (3:1), а детектирование хроматографической зоны β-каротина проводят до обработки пластины проявителем при дневном свете.
Литература:
1. Смирнов В.А. Климочкин Ю.Н. Витамины и коферменты: учебное пособие. Самара: Самар. гос. техн. ун-т. 2008. Ч.2. 91 с.
2. ГОСТ 30627.1-98. Продукты молочные для детского питания. Метод измерения массовой доли витамина А (ретинола).
3. ГОСТ 30627.3-98. Продукты молочные для детского питания. Метод измерения массовой доли витамина Е (токоферола).
4. Eitenmiller R.R., Ye L., Landen W.O. Vitamin Analysis for the Health and Food Sciences // Boca Raton. N.Y. 2008. 664 р.
5. European Pharmacopoeia: Supplement. Strasbourg: Council of Europe. 2001. 3rd ed. 1705 p.
6. ГОСТ Р 54637-2011. Продукты пищевые функциональные. Метод определения витамина D3.
7. ГОСТ Р ЕН 14130-2010. Продукты пищевые. Метод определения витамина С помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.