В начале (I стадия) заболевания рентгенологически пневмоцистная пневмония может выявляться у 60 % больных. У больных СПИД рентгенологическая картина появляется значительно отсроченно от начала заболевания. Даже при явной клинике пневмоцистной пневмонии у больных после трансплантации костного мозга рентгенологическая картина может быть нормальной в 15 % случаев, а у 58 % наблюдаются билатеральные инфильтраты. На мысль, что пневмония может быть пневмоцистной, наводит сочетание дыхательной недостаточности с неизмененной рентгенологической картиной. Однако последующие исследования выявляют в прикорневых отделах легких облаковидное понижение прозрачности и усиление интерстициального рисунка. Далее отмечают мелкоочаговые тени, лежащие в обоих полях симметрично, напоминая крылья бабочки.
В разгаре заболевания (II стадия) в легких появляются обильные очаговые тени, местами сливающиеся в крупные участки уплотнения, перемежающиеся участками вздутия.
Структура легкого становится матовой («ватной»), т. е. по рисунку напоминает тонкий, неравномерно растянутый слой ваты с более или менее плотными участками. Это же понижение прозрачности может выявляться и при рентгенокомпьютерной томографии. У 75 % больных СПИДом определяются диффузные интерстициальные инфильтраты.
III стадия характеризуется наличием лобулярных вздутий, расположенных субплеврально, которые могут привести к их разрыву с образованием сухого серповидного пневмоторакса при неполном спадании легкого, т. к. патологические элементы, заполняющие альвеолярную и бронхиальную системы, препятствуют этому. В результате увеличения общего объема легких диафрагма опущена, иногда даже уплощена.
При клиническом обследовании пациента выявляют следующие изменения лабораторных показателей:
· гипохромную анемию;
· гиперлейкоцитоз до 20—50 × 109/л;
· эозинофилия достигает 14—24 %;
· СОЭ ≥ 50 мм/ч;
· ЛДГ > 250 и более (до 700—800 МЕ/л);
· артериальная гипоксемия (РаО > 80 мм рт. ст. и ниже) характерна для 80 % больных пневмоцистозом;
· увеличение альвеолярно-артериального градиента ((А-а)ДО) характерно для 80 % больных пневмоцистозом;
· уменьшение Т-хелперов (СД4+) > 200 кл/мл3.
Еще до недавнего времени считалось, что увеличение суммарной активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) > 250 и более (до 700—800 МЕ/л), при норме 150—210 МЕ/л говорит об активизации процесса пневмоцистной пневмонии. Работы последних лет показали, что повышенный уровень ЛДГ не является строго специфичным для Pneumocystis jiroveci - инфекции, т. к. выявляется у 60 % больных пневмониями и указывает на паренхиматозное поражение легких.
Патолого-анатомическая картина, как макроскопическая, так и микроскопическая, довольно типичная.
Макроскопически – легкие увеличены, тяжелые, плотные на ощупь, бледно-фиолетового цвета. Ткань легких мясистая, легко разрывается, на разрезе серовато-синюшная, мраморного рисунка. При надавливании из легких вытекает пенистая кровянисто-серозная жидкость.
При микроскопическом исследовании в просвете альвеол и терминальных бронхиол, особенно в пенисто-ячеистых массах, обнаруживается большое количество пневмоцист. В альвеолах, вокруг конгломератов паразита лежат макрофаги, нейтрофильные лейкоциты. Часто наблюдаются макрофаги, в которых лежат пневмоцисты.
5. Лабораторная диагностика
Для диагностики пневмоцистоза необходимо использовать комплекс лабораторных методов исследования, включающий паразитологический и иммунологические тесты (табл. 1).
Таблица 1
Диагностика пневмоцистной инфекции
| Цель исследования | Pneumocystis jiroveci | |
| Методы исследования | Материал исследования | |
| Определение антител класса IgG | ИФА, НРИФ | Сыворотка крови |
| Определение антител класса IgM | ИФА, НРИФ | Сыворотка крови |
| Определение возбудителя, антигенов и ДНК | 1. Морфология 2. НРИФ 3. ПЦР | Мокрота, бронхо-альвеолярный лаваж, биоптат |
5.1. Правила сбора клинического (секционного) материала для паразитологического и иммунологических исследований
5.1.1. Для патолого-анатомического исследования в течение первых суток после гибели больного производят взятие фрагментов легочной ткани, включающей альвеолы, в стерильные одноразовые флаконы стерильными инструментами. Работу проводят с соблюдением противоэпидемического режима согласно СП 1.3.1285—03 «Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенности (опасности)». Из полученных материалов приготавливают мазки-отпечатки легкого или мазки из пенистого содержимого альвеол.
5.1.2. При жизни легочную ткань получают при проведении трансбронхиальной биопсии при фибробронхоскопии, что позволяет выявить пневмоцисты в 66—98 %, однако этот метод получения материала показан далеко не всем больным. У больных, которым по той или иной причине противопоказано проведение трансбронхиальной биопсии при прогрессирующем течении заболевания, возможно получение диагностического материала с помощью чрезкожной интраторакальной аспирации. Метод открытой биопсии легкого дает наилучшие (100 %) результаты и приравнивается по результату к хирургическому вмешательству, при этом получается достаточно большой объем материала для исследования и ложноотрицательный результат полностью исключается.
5.1.3. В клиниках исследуют бронхоальвеолярный лаваж для выявления цист и трофозоитов. С помощью фибробронхоскопа блокируют один из дистальных бронхов и вводят в него порциями по 20 мл физиологического раствора, общее количество которого составляет 100—200 мл, с последующей эвакуацией. Специалисты считают этот метод простым и безопасным.
5.1.4. Более простым методом получения материала для выделения пневмоцист является получение индуцированной мокроты. Через ультразвуковой распылитель делается ингаляция 3 %-м раствором хлорида натрия и собирается мокрота в стерильную чашку. Если мокрота легко отделяется, ее надо собирать несколько раз в течение суток в одну посуду, сохраняя до исследования при t 4 °С.
5.1.5. Для получения материала от детей раннего возраста можно использовать прямую ларингоскопию без медикаментозной подготовки или метод воспроизведения кашлевого рефлекса путем надавливания на корень языка. Слизь при этом забирается тампоном.
Из полученного материала готовят мазки для дальнейшего исследования.
Лаважную жидкость центрифугируют при 1,5 тыс. об./мин, разводя фосфатным буфером до нужной концентрации, и готовят мазки.
Мокроту для разжижения обрабатывают муколитическим раствором спутолизина (дитиотреитол), нейтрализуют фосфатным буфером, инкубируя 3 мин, центрифугируют при 1,5 тыс. об./мин и готовят мазки.
Все перечисленные материалы исследуют как паразитологическими методами с целью выявления всех форм пневмоцист, так и иммунологическими на наличие антигенов Pneumocystis jiroveci.
5.1.6. Для иммунологического исследования сыворотки взятие крови производят из вены. Кровь центифугируют при 1 500 об./мин 10 мин и отсасывают сыворотку, которую можно сохранять при t 4—6 °C в течение недели или в замороженном состоянии при –20 °C достаточно долго. Исследуют антитела в НРИФ и ИФА.
5.2. Паразитологический метод основан на прямом морфологическом выявлении пневмоцист в биологическом материале (легочной ткани, бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ), индуцированной мокроте (ИМ).
Для окраски паразитологических препаратов с целью выявления Pneumocystis jiroveci используют классические методы: импрегнация метенамин-серебряным нитратом по Гомори, окраска толуидиновым синим, гематоксилином и эозином, по Граму и раствором Шиффа, а также методом Романовского-Гимза.
Диагноз «пневмоцистоз» основывается на выявлении паразитов характерных размеров и формы (цисты, прецисты и трофозоиты) или по характерной эозинофильной пене (окраска гематоксилином и эозином), внутри которой лежат цисты.
При серебрении по Гомори полисахариды стенки цисты окрашиваются скоплением осадка серебра и создается впечатление, что она нарисована черной тушью, трофозоиты при этом не окрашиваются.
Толуидиновый синий также окрашивает стенку цисты, но в пурпурно-фиолетовый цвет. Окраске по Граму и реактивом Шиффа подвергаются как цисты, так и трофозоиты.
Наиболее универсальным для выявления цист, трофозоитов и спорозоитов является метод Романовского-Гимза. Характерным и диагностическим является обнаружение розовых цист, оболочка которых при работе микровинтом микроскопа имеет вид прозрачного кольца, а внутри лежат от 4 до 8 красно-фиолетовых включений. Наличие большого количества трофозоитов говорит об активации инфекционного процесса.
Витальная окраска нейтральным красным также позволяет выявить возбудителя в активной фазе.
Все перечисленные методы окраски требуют высокой квалификации исследователя для точной идентификации Pneumocystis jiroveci; к тому же эти методы служат лишь для индикации и большинство из них направлены на общие грибные полисахариды оболочки цист.
5.3. Молекулярная диагностика пневмоцистоза
В настоящее время лицензированных молекулярно-генетических тест-систем для диагностики пневмоцистоза пока нет.
Американским исследователям (T. K. Jensen, M. Boye, V. Bille-Hansen, 2001) удалось применить гибридизацию in situ в целях выявления Pneumocystis carinii в легких крыс и человека с использованием биотинимеровананных олигонуклеотидных зондов, нацеленных на рибосомальную РНК (rRNA), а также в легких человека и хорьков путем флуоресцентной гибридизации in situ, нацеленной на специфические малые подгруппы рРНК генов.
В ряде работ показано определение пневмоцист методом ПЦР путем амплификации ДНК паразита с праймерами, специфичными для митохондриальной рРНК, в серии конечных разведений исследуемых материалов. Исследуемые образцы подвергали перевариванию притеинкиназой К в течение 2 ч при 56 °С, экстрагировали фенол-хлороформом, разбавляли и амплифицировали с pAZ102E и Н. Затем проводили электрофорез продуктов ПЦР в 2 % агарозном геле и окрашивали этидиум-бромидом. ДНК экстрагировали из исследуемого материала, серийно разбавляли до разведения 1: 20 000. Хотя этот метод не стандартизирован, но его результаты хорошо согласовывались с результатами, полученными другими методами.
5.4. Иммунологические методы выявления маркеров пневмоцистоза
Иммунофлюоресцентные методы для выявления цист и трофозоитов основаны как на использовании моноклональных, так и поликлональных антител. Мышиные моноклональные антитела могут быть получены против цист или против трофозоитов, также против отдельных антигенов Pneumocystis jiroveci/carinii. В настоящее время только две фирмы в Европе выпускают тест-системы для диагностики пневмоцистоза:
· Германия выпускает тест-системы РИФ на основе моноклональных антител для выявления пневмоцист в мазках из мокроты и бронхоальвеолярных смывов.
· Франция выпускает тест-системы ИФА для определения антител к Pneumocystis jiroveci в сыворотке крови.
В России производят «ПневмоцистоФлюоАГдиагностику» (регистрационное удостоверение № ФСР 2009/ 06120) – набор реагентов предназначен для проведения непрямой реакции флюоресценции для выявления всех форм пневмоцист (цист, прецист и трофозоитов) в мазках, приготовленных из мокроты, бронхоальвеолярного лаважа.
Иммунологические методы, выявляющие специфические антитела классов IgG и IgM (НРИФ и ИФА), также играют значительную роль в диагностике пневмоцистоза, особенно при эпидемиологических исследованиях или при диагностике, когда у больного невозможно взять лаважную жидкость или мокроту. Антитела класса G среди здорового населения выявляют достаточно часто (60—80 %). Наличие анамнестических анти-Pneumocystis jiroveci класса IgG говорит о встрече с этим инфекционным агентом в прошлом в течение жизни. Исследование антител должно происходить в динамике при обязательном титровании сыворотки. Выявление 4-кратного нарастания IgG и/или определение антител IgM против Pneumocystis jiroveci говорит об остром инфекционном процессе, вызванном этим возбудителем. Обнаружение антител к пневмоцисте у детей раннего возраста (до 1 года) имеет диагностическое значение.
Набор реагентов «ПневмоцистоСтрип» (регистрационное удостоверение № ФСР 2009/0619) предназначен для выявления антител к антигену Pneumocystis carinii в сыворотках крови больных детей и взрослых с подозрением на пневмоцистоз и у здоровых при проведении эпидемиологических исследований. Этот набор основан на непрямом иммуноферментном анализе на твердой фазе с использованием пероксидазы хрена в качестве маркерного фермента.
Применение комплекса диагностических методов позволяет проводить своевременную качественную прижизненную диагностику, за которой должна последовать адекватная терапия.
На основании анализа контингентов, входящих в группы риска в отношении пневмоцистоза, и методов диагностики, применяемых в наших исследованиях, был разработан предлагаемый алгоритм лабораторной диагностики пневмоцистоза (рис. 1).
6. Профилактика и лечение пневмоцистоза
6.1. Профилактика
Профилактика пневмоцистоза может быть разделена на санитарно-эпидемиологическую и медикаментозную.
Учитывая широкую распространенность этого возбудителя и высокий процент носителей среди взрослого населения, необходимо проводить обследования по эпидемиологическим показаниям медицинского персонала детских учреждений, больниц, онкологических и гематологических центров, центров трансплантации и сердечно-сосудистой хирургии на носительство Pneumocystis jiroveci, чтобы исключить внутрибольничную инфекцию.
Полноценное питание уменьшает риск заболевания пневмоцистозом. Как уже говорилось, важность белкового питания нами показана на модели мини-свиней. Румынскими учеными показано, что в 90 % подтвержденных случаев пневмоцистоза белковое недоедание является самым тяжелым фактором риска при заболевании детей раннего возраста.
Медикаментозная профилактика пневмоцистной пневмонии делится на первичную и вторичную.
Первичная профилактика должна предотвратить пневмоцистоз у еще не болевших людей. Основной критерий для начала профилактики – снижение числа СД4+ лимфоцитов ниже 200. Тем не менее до сих пор нет единого мнения когда начинать первичную профилактику.
Вторичная профилактика проводится в целях предупреждения повторного заболевания пневмоцистной пневмонией и подразумевает постоянный прием Бисептола 480 в профилактической дозе препарата после первичного эпизода заболевания.
Ориентиром для начала медикаментозной профилактики пневмоцистоза у больных СПИД, гемобластозами или при трансплантации органов служит уровень СД4+ ниже 300 в мл3, также увеличение альвеолярно-артериального кислородного градиента (А-а > 25 мм рт. ст.). При этом нужно учитывать, что у больного не развивается пневмоцистная пневмония пока он принимает лекарственные препараты. Для отдельных групп больных профилактика может продолжаться 6—12 мес.
Наиболее эффективным противоэпидемическим мероприятием является раннее выявление и изоляция больных, что позволяет предотвратить возникновение и распространение внутрибольничной инфекции. После выписки больных необходима заключительная дезинфекция палат: влажная уборка, ультрафиолетовое облучение и обработка предметов 5 %-м раствором хлорамина.
6.2. Лечение
Применение высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ)
вызывает резкое снижение случаев вторичных осложнений ВИЧ-инфекции, включающих в т. ч. и пневмоцистную пневмонию. Тем не менее для лечения пневмоцистоза необходима максимально этиотропная терапия, при этом нужно подчеркнуть, что существующие антибиотики против этого возбудителя не эффективны.
Наиболее часто при лечении детей, а также больных СПИД, гемобластозами и при трансплантации органов с клиникой пневмоцистоза выбирают триметоприм-сульфаметоксазол, который является ингибитором системы фолиевой кислоты. Однако у 60 % пациентов возможно развитие побочных реакций, таких как лейкопения, сыпь, тошнота, анемия, нейтропения. У 50 % больных СПИД эти явления могут проявиться на 11 день с начала применения препарата.
В настоящее время разрабатываются новые классы противогрибковых антибиотиков, активных в отношении Pneumocystis jiroveci – пневмокандины и бенаномицины.
В настоящее время ведется поиск и разработка новых препаратов, активно действующих на Pneumocystis jiroveci, из уже известных групп, как например, WR6026 – представитель 8-аминохинолинов и вместе с тем новые селективные ингибиторы дегидрофолатредуктазы.
Еще одним направлением (пока экспериментальным) в терапии пневмоцистоза является применение синтетического сурфактанта в сочетании со стандартной терапией.
Необходимо отметить, что после проведенного лечения и выздоровления полного восстановления сурфактантной системы легких не происходит. Это может явиться причиной колонизации легких другими микроорганизмами. Это показано рядом авторов, в т. ч. и нами в материалах, приведенных ранее.
Список литературы
1. Галстян Г. М., Городецкий В. М., Тихонова Л. Ю. и др. Клинические проявления, диагностика и течение пневмоцистной пневмонии у больных с заболеваниями системы крови // Терапевтический архив. 1999. № 7. С. 33—39.
2. Ермак Т. Н., Литвинова Н. Г., Самитова Э. Р. и др. Пневмоцистная пневмония в сочетании с туберкулезом как первые клинические проявления на поздних стадиях ВИЧ-инфекции // Терапевтический архив. 2005. № 11. С. 21—23.
3. Ермак Т. Н., Ревкова Т. М., Скворцов П. А. Клиническая диагностика пневмоцистной пневмонии у больных ВИЧ-инфекцией // Эпидемиол. и инфекц. бол. 2004. № 4. С. 52—54.
4. Ермак Т. Н., Самитова Э. Р., Токмалаев А.К. и др. Пневмоцистная пневмония, туберкулез легких, их сочетание у больных ВИЧ-инфекцией // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2008. № 3. С. 34—38.
5. Ковалева Е.П., Семина Н. А., Ермак Т. Н. Пневмоцистоз – от зооноза к антропонозу // Мат. VIII съезда ВОЭМП /МЗ РФ, РАМН, ВНПОЭМП. М., 2002.
6. Кунакбаева А. Ф., Зигангирова Н. А., Каражас Н. В. и др. Выявление ДНК Pneumocystis carinii в клиническом материале у детей с респираторной патологией // ЖМЭИ. 2006. № 6. С. 44—47.
7. Кунакбаева А. Ф., Каражас Н. В., Зигангирова Н. А. и др. Выявление ДНК Pneumocystis carinii в пробах воздуха и смывах с медицинского оборудования в больничных стационарах //ЖМЭИ, 2006. № 7. С. 100—103.
8. Лысенко А. Я., Турьянов М. Х., Лавдовская М. В. и др. ВИЧ-инфекция и СПИД-ассоциируемые заболевания. М., 1996.
9. Пневмоцистоз – эпидемиология, клиника, диагностика и лечение: Метод. рекомендации /Правительство Москвы, Комитет здравоохранения; Сост. Н. В. Каражас, Н. А. Малышев, К. З. Смагулов. М., 1999. 17 с.
10. Сафонова А. П., Шипулина О. Ю., Шахгильдян В. И. и др. Молекулярная диагностика пневмоцистной пневмонии у ВИЧ-инфицированных больных с легочной патологией // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2008. № 3. С. 58—60.
11. Юдицкий М. В., Пироцкий Н. Н., Клюшникова И. Л. и др. Особенности клиники туберкулезного процесса у больных на поздних стадиях ВИЧ-инфекции // В кн.: Сборник материалов Научно-практической конференции «Проблемы туберкулеза у больных ВИЧ-инфекцией» М., 2005. С. 119—120.
12. Ascioglu S., Rex J. H., de Pauw B. et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus// Clin.Infect.Dis, 2002. vol. 34-p. 7.
13. Bartlett M. S., Vermund S. H., Jacobs R. et al. Detection of Pneumocystis carinii DNA in air samples: likely environmental risk to susceptible persons // J.Clin.Microbiol. Oct. 1997. vol. 35. P. 2511—2513.
14. Caliendo A. M., Peter L. Hewitt, Jessica M. Allega, et al. Perfomance of a PCR Assay for Pneumocystis carinii from Respiratory Specimens // J.Clin.Microbiol. Apr. 1998. vol. 36. № 4. Р. 979—982.
15. Collin B. A., Ramphal R. Pneumonia in the compromised host including cancer patients and transplantant patients // Infect. Dis. Clin. North. Am. 1998. vol. 12. Р. 781.
16. Curtis J.Randall, Paul R. Yarnold, David N. Schwartz et al. Improvements in Outcomes of Acute Respiratory Failure for Patients with Human Immunodeficiency Virus-related Pneumocystis carinii Pneumonia // Am.J.Respir.Crit.Care Med. Aug. 2000. vol. 162. № 2. Р. 393—398.
17. Gigliotti F, Haidaris C. G. Antigenic characterization of Pneumocystis carinii //Semin. Respir. Infect. 1998 Dec vol. 4. № 13. Р. 313—22.
18. Fishman J. A. Prevention of infection due to Pneumocystis carinii // Antimicrob. Agents. Chemother. 1998, vol. 42. Р. 995.
19. Helweg-Larsen J., Jensen J. S., Benfield T. et al. Diagnostic use of PCR for detection of Pneumocystis carinii in oral wash samples // J.Clin.Microbiol. 1998, vol. 36, 2068—2072.
20. Hughes Walter T. Pneumocystis carinii vs. Pneumocystis jiroveci: Another Misnomer // Emerg. Infect. Dis. Feb. 2003. vol. 9. № 2. Р. 276—277.
21. Jensen T. K., Boye M., Bille-Hansen V. Application of Fluorescent In Situ Hybridization for Specific Diagnosis of Pneumocystis carinii Pneumonia in Foals and Pigs // Vet Pathol. 2001. vol. 38. Р. 269—274.
22. Koziel H., Phelps D. S., Fishman J. A. et al. Surfactant protein-A reduces binding and phagocytosis of Pneumocystis carinii by human alveolar macrophages in vitro // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1998, vol. 18.
Р. 834—843.
23. Ledergerberg B., Mocroft A., Reiss P. et al. Discontinuation of secondary prophylaxis against Pneumocystis carinii pneumonia in patients with HIV infections who have a response to antiretroviral therapy // N. Engl. J. Med. 2001; 344. Р. 168—174.
24. Nevez G., Raccurt C., Jounieaux V. et al. Pneumocystosis versus pulmonary Pneumocystis carinii colonization in HIV-negative and HIV-positive patients // AIDS. 1999. Mar. 13 (4). Р. 535—6.
25. Vargalis S. L., Carolina A.Ponce, Francis Gigliotti et al. Transmission of Pneumocystis carinii DNA from a Patient with P. carinii Pneumonia to Immunocompetent Contact Health Care Workers // J.Clin.Microbiol. Apr. 2000. vol. 38. № 4. Р. 1536—1538.