ЗАНЯТИЕ 13
Тема: Микробиологическая диагностика стафилококковых инфекций.
Контрольные вопросы:
1. Классификация и морфобиологические свойства стафилококков.
2. Факторы вирулентности стафилококков.
3. Экология, эпидемиология и особенности патогенеза стафилококковых инфекций.
4. Роль стафилококков в развитии внутрибольничных инфекций (ВБИ).
5. Материал и методы микробиологичекой диагностики стафилококковых инфекций.
6. Специфическая профилактика и терапия стафилококковых инфекций.
7. Этиотропная терапия стафилококковых инфекций. Особенности лечения заболеваний, вызываемых MRSA/MRSE.
8. Роль неспецифической профилактики в предупреждении ВБИ стафилококковой этиологии.
9. Особенности неспецифической профилактики ВБИ, вызываемых MRSA/MRSE.
Методические указания к выполнению исследовательского задания:
1. Проведите бактериологическое исследование по обнаружению и выделению предполагаемого возбудителя из гноя, для чего:
1 этап. Приготовьте препарат-мазок из гноя, взятого от больного с закрытым абсцессом в предверии носа, окрасьте по Граму и промикроскопируйте. Результаты исследования внесите в протокол и сформулируйте ответ.
Для приготовления препарата на предметное стекло нанесите каплю физиологического раствора, внесите в нее гной и равномерно распределите его петлей. Препарат высушите, зафиксируйте в смеси Никифорова в течение 20 мин. и окрасьте по Граму.
В биоматериале стафилококки – это грамположительные мономорфные кокки диаметром 0,5-1,5 мкм, которые располагаются одиночно, парами и небольшими группами среди лейкоцитов. Это позволяет сделать вывод о выявлении грамположительных кокков и продолжить исследование.
Исследуемый материал засевают стандартной бактериологической петлей на чашки с КА и ЖСА методом секторных посевов (метод Gould). Вначале делают 30-40 штрихов в секторе I, затем прожигают петлю и делают 4 штриха из сектора I в сектор II и таким же способом из сектора II в III, из III - в IV сектор, каждый раз прожигая петлю (приложение 1, рис. 1).Чашки инкубируют при 370 в течение 24-48 ч.
2 этап. Оцените результаты посева гнойного материала того же больного на средах ЖСА и КА, дайте характеристику выросшим колониям.
Для количественного учета подсчитывают выросшие колонии и определяют количество соответствующих микроорганизмов в 1 мл исследуемого материала (приложение 1, таблица). Интерпретация результатов: величина ³ 105 КОЕ/мл свидетельствует об этиологической роли микроорганизмов.
При наличии в патологическом материале стафилококков рост будет наблюдаться одновременно на ЖСА и КА. На ЖСА стафилококки растут в виде круглых, диаметром 1-3 мм, непрозрачных, выпуклых, блестящих, пигментированных колоний, имеющих ровный край, гомогенную структуру и маслянистую консистенцию. Вокруг колоний стафилококков, обладающих лецитиназной активностью, образуется радужный венчик. На КА может наблюдаться гемолиз, хорошо видимый в проходящем свете. Для получения чистой культуры 2-3 характерные колонии пересевают на скошенный агар и инкубируют при 37о в течение 16-18 ч.
3 этап. Изучите характер роста пиокультуры на скошенном агаре, приготовьте фиксированный препарат, окрасьте по Граму и промикроскопируйте. Дайте заключение.
В препарате из суточной культуры стафилококки образуют характерные скопления, напоминающие гроздья винограда.
В том случае, если выделенная культура чистая, приступают к дальнейшему исследованию. Для определения родовой принадлежности и дифференциации от рода Micrococcus определяют способность к росту при 450 и при высокой концентрации NaCl (10-12%).
Для определения видовой принадлежности определяют коагулазную активность и способность окислять углеводы при посеве на «пестрый ряд» (см занятия №5,6 и таблицу №1).
В случае выделения S.aureus для определения источника и путей распространения инфекции проводится фаготипирование культуры (см занятие №8).
Для этиотропной терапии определяют метициллинорезистентность исследуемой культуры (см занятие №12) и в случае выделения MSSA/MSSE определяют антибиотикограмму методом дисков (см занятия №5,6).
4 этап. Учтите результаты посева культуры на комплекс питательных сред, определите видовую принадлежность культуры, метициллинорезистентность и в случае необходимости фаговар и антибиотикограмму.
Заполните бланк-направление и бланк-ответ из бак.лаборатории (см. приложение 2).
Таблица №1
Дифференцирующие свойства видов рода Staphylococcus, наиболее часто
встречающихся в клиническом материале
| №№ | Виды | Плазмоко- агуалаза | Ман-нит | Маль-тоза | Лакто-за | Сахаро-за | Ксило-за | Трега-лоза |
| S.aureus | + | + | + | + | + | + | + | |
| S.intermedius | + | + | - | |||||
| S.hyicus | + | - | - | |||||
| S.epidermidis | - | - | (+) | + | - | - | ||
| S.saprophyticus | - | + | + | + | - | - | ||
| S.xylosus | - | + | + | + | + | |||
| S.haemolyticus | - | + | - | + | ||||
| S.warneri | - | (+) | - | + | - | + | ||
| S.hominis | - | - | + | - | + | |||
| S.capitis | - | + | - | + | + | - |
Обозначения:
+ 90% и более положительных реакций;
- 90% и более отрицательных реакций;
2. Проведите посев отделяемого из носа на ЖСА методом «штрих с площадкой» с целью выявления бактерионосительства S. aureus.
Одной из мер профилактики ВБИ является выявление бактерионосителей S.aureus среди медицинского и обслуживающего персонала ЛПУ с последующей санацией. Материалом для обязательного исследования является отделяемое передних отделов носа; исследование отделяемого из зева проводят при наличии воспалительных процессов в зеве. Забор материала из передних отделов носа осуществляется одним стерильным сухим ватным тампоном, который сначала вводят в один, а потом в другой носовой ход, не касаясь крыльев носа снаружи. Посев исследуемого материала на половину чашки Петри с ЖСА, элективной средой для выделения стафилококков, осуществляют не позже 2-х ч после забора методом “штрих с площадкой”. Чашки инкубируют 24 –48 ч при 37°С.
При наличии в посевах характерных для стафилококков колоний их отсевают на скошенный агар для последующего определения видовой принадлежности и ориентировочно определяют массивность их роста в крестах:
++++ - сливной рост;
+++ - сплошной рост изолированных колоний;
++ - значительный рост (до 100 колоний);
+ - единичные колонии (10-25 колоний).
Выделение от обследуемого культуры S.aureus в количестве 103 и больше микробных клеток, снимаемых с тампона (сливной и сплошной рост при посеве на ЖСА), является показателем высокой обсемененности слизистых носа. При этом происходит выделение S.aureus во внешнюю среду как при различных экспираторных актах, так и при спокойном дыхании. Следовательно, обследуемый является бактерионосителем S.aureus и представляет потенциальную опасность.
Для профилактики ВБИ проводят санацию бактерионосителей. В тех случаях, когда не удается добиться санацией снижения или полного избавления от носительства стафилококка, необходимо правильное ношение маски, закрывающей рот и нос. При этом необходимо иметь график ношения масок и проводить их смену каждые 3 ч. При отсутствии положительных результатов при лечении хронических воспалительных процессов ВДП медицинских работников переводят на другую работу.
3. Ознакомьтесь и опишите в протоколе биопрепараты, указав, что они содержат, для чего и как применяются (стафилококковый анатоксин, стафилококковый иммуноглобулин, лечебный стафилококковый бактериофаг, типовые стафилококковые бактериофаги).
Вопросы для самоконтроля:
1. Назовите типовое проявление стафилококковой инвазии.
2. Обоснуйте опасность генерализации стафилококковой инфекции при локализации пиогенного процесса в зоне носогубного треугольника.
3. Назовите правила забора и доставки материала с целью диагностики стафилококковых инфекций.
4. Назовите особенности бактериологического исследования на стафилококки.
5. Обоснуйте необходимость использования метода секторных посевов при диагностике стафилококковых инфекций.
6. Обоснуйте какой объем крови необходимо для выделения гемокультуры стафилококков и тактику ее посева на 1 этапе бак.метода.
7. Назовите и обоснуйте сроки выдачи результатов бактериологического исследования при выделении пио- и гемокультуры стафилококков.
8. Какое значение имеет бактерионосительство стафилококков в условиях ЛПУ.
9. Обоснуйте тактику антибиотикотерапии в случае выделения метициллинорезистентных (MRSA, MRSE) и метициллиночувствительных (MSSA, MSSE) штаммов стафилококков.
10. Назовите основные меры профилактики ВБИ стафилококковой этиологии.
11. Назовите особенности профилактики ВБИ, вызываемых MRSA, MRSE.
Литература:
Учебники:
1. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М.: ООО «МИА», 2005. – С.352-359.
2. Поздеев О. К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В. И. Покровского. - М.: ГЭОТАР Медицина, 2001. – С.281-287.
Лекции.
Тесты.
Приложение №1
Рис. 1 Метод секторных посевов (метод Gould)
 |
Показатели микробной обсемененности жидких материалов в зависимости от числа колоний,
выросших на секторах плотной питательной среды
| Кол-во м/о в 1 мл материала | Число колоний | ||||||
| I сектор | II сектор | III сектор | IV сектор | ||||
| < 103 | 1-6 | ||||||
| 103 | 8-20 | ||||||
| 5 х 103 | 20-30 | ||||||
| 104 | 30-60 | ||||||
| 5 х 104 | 70-80 | ||||||
| 105 | 100-150 | 5-10 | |||||
| 5 х 105 | > 150 | 20-30 | |||||
| 106 | не сосчитать | 40-60 | |||||
| 5 х 106 | не сосчитать | 100-140 | 10-20 | ||||
| 107 | не сосчитать | не сосчитать | 30-40 | ||||
| 5 х 107 | не сосчитать | не сосчитать | 60-80 | единичные | |||
| 108 | не сосчитать | не сосчитать | 80-140 | до 25 | |||
Приложение №2
Медицинская документация
Форма № 204/у
Утв. МЗ СССР 04.10.80 № 1030
НАПРАВЛЕНИЕ №_______
на микробиологическое исследование
«_____»____________________200__г. ____________час.__________мин.
дата и время взятия материала
В ______________________________________________________лабораторию
Вид исследования____________________________________________________
Ф. И. О. ____________________________________________________Возраст__________________
Отделение ___________________________________________________________________________
Диагноз, дата заболевания______________________________________________________________
Показания к обследованию: больной, переболевший, реконвалесцент, бактерионоситель, контактный, профобследование (нужное подчеркнуть)
Материал: кровь, мокрота, кал, дуоденальное содержимое, пунктат, спинномозговая жидкость, раневое отделяемое, гной, выпот, секционный материал, мазок (подчеркнуть, вписать) ____________
Должность, фамилия, подпись лица, направляющего материал _______________________________
____________________________________________________________________________________
Медицинская документация
Форма № 239/у
Утв. МЗ СССР 04.10.80 № 1030
РЕЗУЛЬТАТ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ №______
«_____»____________________200__г.
дата взятия биоматериала
Ф. И. О. ____________________________________________________Возраст__________________
Отделение ___________________________________________________________________________
При исследовании_____________________________________________________________________
указать материал и результат
АНТИБИОГРАММА
Ристомицин 1 2 3 Канамицин 1 2 3
Гентамицин 1 2 3 Бензилпенициллин 1 2 3
Доксициклин 1 2 3 Ампициллин 1 2 3
Эритромицин 1 2 3 Карбенициллин 1 2 3
Линкомицин 1 2 3 Ципрофлоксацин 1 2 3
Левомицетин 1 2 3 Оксациллин 1 2 3
Рифампицин 1 2 3 Цефалекцин 1 2 3
Фузидин 1 2 3 Олеандомицин 1 2 3
Условные обозначения: 1 - культура устойчива; 2 - умеренно устойчива; 3 – чувствительна
«_____»____________________200__г. Подпись________________________
дата выдачи результата