Свежую или размороженную рыбу (5-10 экземпляров, в зависимости от размеров) разделать на тушку, аккуратно отделить внутренние органы, тщательно зачистить брюшную полость, отделить мышечную ткань от костей и кожи.
Пищеварительные органы (желудок, пилорические придатки, кишечник, печень) освободить от остатков пищи, ожирков, гонад. Промыть водой, подсушить на марле или фильтровальной бумаге.
Мышечную ткань и отдельно пищеварительные органы взвесить на технических весах с точностью до 0,05 г. Определить соотношение массы и пищеварительных органов, полученных при разделке рыбы. С учетом полученного соотношения рассчитать, какая масса пищеварительных органов (М) приходится на 20 г мышечной ткани.
Мясо рыбы пропустить два раза через мясорубку и хорошо перемешать. Внутренние органы как можно мельче разрезать ножом или ножницами и растереть в ступке. Измельченные ткани (фарш и пищеварительные органы) положить раздельно в два бюкса с крышкой и палочкой для взятия навесок.
В шесть стаканчиков по 50 мл взять навески по 20 г мышечной ткани (фарша) и М2 пищеварительных органов с точностью до 0,05 г (в каждый стаканчик).
Если при определении соотношения массы мышц и пищеварительных органов получилось 10:1, то в этом случае навеску внутренностей взять в количестве 2 г.
Навески тканей количественно (без потерь) перенести с помощью 50 мл буферного раствора с заданным рН в мерные колбы на 200 мл, распределив их согласно данной таблице.
| Маркировка колб | Навеска, г | рН | ||
| Фарша | Пищеваритель- ных органов | Буферного раствора | Смеси | |
| 1 К | 20,0 | М (или 2 г) | 7,0 | 6,7 |
| 1 Т | 20,0 | М -«- | 7,0 | 6,7 |
| 2 К | 20,0 | М-«- | 10,0 | 8,0 |
| 2 Т | 20,0 | М-«- | 10,0 | 8,0 |
| 3 К | 20,0 | М-«- | 1,8 | 3,1 |
| 3 Т | 20,0 | М-«- | 1,8 | 3,1 |
|
|
Для ускорения работы в колбы 3К и 3Т можно взять навески по 20 г фарша и проводить опыт при рН смеси 6,7.
Все колбы встряхивают на механической мешалке в течение 15 мин. После этого в каждую колбу добавляют по 1 мл толуола в качестве антисептика. Затем контрольные образцы с индексом «К» помещают в кипящую водяную баню на 10 мин для инактивации ферментов. После прогрева на водяной бане контрольные образцы (колбы с маркировкой 1 К, 2 К и 3 К) используют для определения начального содержания азота конечных аминогрупп (Nам) методом формольного титрования.
Колбы с активным комплексом ферментов (1 Т, 2 Т и 3 Т) помещают в термостат и выдерживают при температуре 37оС в течение 1,5-2,0 часов
После термостатирования колбы 1 Т, 2 Т и 3 Т помещают в кипящую водяную баню на 10 мин и инактивируют ферменты так же, как и в контрольных пробах. При определении активности комплексов протеиназ в кислой среде (колба 3 Т) при плохой коагуляции белка можно добавить 1 н раствора едкого натра в количестве 10% к массе содержимого.
После нагревания колбы охлаждают под струей водопроводной воды, доводят до метки дистиллированной водой (до 200 мл) тщательно перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр в чистые и сухие конические колбы.
В фильтратах как контрольных, так и опытных проб определяют формольно-титруемый азот. В коническую колбу на 100 мл приливают 25 мл фильтрата, добавляют 5 капель фенолфталеина и осторожно по каплям нейтрализуют 0,1 н раствором едкого натра до слабого розового окрашивания. При избытке раствора щелочи пробу вначале оттитровывают 0,1 н раствором соляной кислоты.
|
|
К нейтрализованному фильтрату добавляют 10 мл 37-40%-ного раствора формалина, предварительно нейтрализованного по фенолфталеину. После перемешивания содержимое колбы титруют 0,1 н раствором едкого натра.
Для определения кислотности формалина проводят холостой опыт. В коническую колбу приливают 25 мл дистиллированной воды, 10 мл формалина и титруют в присутствии фенолфталеина до слабо-розового окрашивания.
Азот конечных аминогрупп (мг/г) вычисляют по формуле:
,
где: V1 - количество 0,1 н раствора щелочи, израсходованной на титрование в рабочей пробе после добавления формалина, мл;
V2 - количество щелочи, пошедшей на титрование в холостой пробе, мл;
V3 - объем мерной колбы, мл;
V4 - объем фильтрата, взятый для титрования, мл;
К - коэффициент нормальности раствора щелочи;
1,4 - количество аминного азота, соответствующее 1 мл точно 0,1 н раствора едкого натра, мг;
m - масса навески (фарша и внутренностей), г.
Количество аминного азота (конечных аминогрупп) в пробах до (Nам к) и после термостатирования (Nам Т) определить как среднее из трех параллельных результатов титрования.
Рассчитать активность комплексов протеиназ в кислой среде, щелочной среде и при естественном значении рН (6,7) по приросту азота конечных аминогрупп за 1 час гидролиза на 1 г мышечной ткани:
АКП = 
, мг Nам /г*час
АКП = 
, ед/г*час
По результатам экспериментов, проведенных студентами всей группы составить сводную таблицу и сделать выводы об активности комплекса протеиназ (АКП) различных видов рыб в зависимости от рН среды.