Оптимальные результаты получают, когда материал берут в транспортное тиогликолевой среду и в нем доставляют в лабораторию. Если посевы делают не позднее 24 ч, транспортную среду не используют. Для выделения кампило-и геликобактерий чаще применяют среду Бутцлера (до кровяного агара добавляют цефоперазон - ЗО мг / л, рифампицин - 10 мг / л и амфотерицин В - 2 мг / л). Антибиотики подавляют рост сопутствующей микрофлоры. Посевы атмосфере 10% С02пры температуре 25 ° С, 37 ° С и 42 ° С в течение 24-72 час. Кампилобактерии образуют два типа колоний: 1) правильной круглой формы с ровными краями диаметром 1-2 мм, блестящей выпуклой поверхностью, прозрачные, гомогенные, 2) неправильной округлой формы диаметром 2-8 мм, бесцветные или светло-серого цвета, прозрачные, напоминают капли воды. При посеве количественным методом рост колоний, как правило, обнаруживают на третьем и четвертом квадрантах, но нужно тщательно осматривать всю чашку, поскольку они могут вырасти только на первом квадранте в окружении колоний сопутствующей фекальной микрофлоры. Идентификация колоний кампило-и геликобактерий не вызывает трудностей для опытного бактериолога. Типичные колонии исследуют микроскопически, окрашивая препараты по Граму. В мазках возбудители имеют вид тонких, изогнутых, чаще спиралевидных клеток, могут иметь один и более витков и достигать в длину до 8 мкм. У культур, которые выращивали в течение 72 ч и дольше, клетки могут приобретать кокоподибнои "формы, что может привести к ошибкам в идентификации. Затем выделяют чистую культуру, которую идентифицируют по ряду признаков: выделение оксидазы, каталазы, уреазы, рост при температуре 25 ° С, 37 ° С и 42 ° С, гидролиз гиппурат, восстановления нитратов, чувствительность к цефалотину.
Для серотипирования кампило - и геликобактерий используют реакцию агглютинации со стандартными диагностическими сыворотками и суспензией прогретых культур. Хорошие результаты типирования получены также в реакциях коаглютинации, латекс-агглютинации и непрямой гемагглютинации. Установлено 50 серотипов С. jejuni и 20 серотипов С. coli, но их количество из года в год растет. Еще более точные результаты серотипирования получены при использовании метода иммуноферментного анализа. В частности, разработана надежная тест-система для определения антигенов Н pylori в биоптатах слизистой оболочки желудка и кишечника.
Серологический метод диагностики заболеваний проводят значительно реже. Для выявления антител можно использовать практически все серологические тесты. Но предпочтение отдают реакции непрямой имунофлуоресценциита метода иммуноферментного анализа. Можно применяемые в реакции обычной агглютинации, латекс-агглютинации и непрямой гемагглютинации. Имеются сообщения об использовании иммуноблоттинга и радиоиммунного метода для определения антител к C.jejuni и Н.руиоги.
29. Морфобиологические св-ва возбудителей зоонозных инфекций (сибирская язва, бруцеллёз, туляремия, чума).
Общие черты зоонозных инфекций:
● Могут поражать человека, представляют собой карантинные особо опасные инфекции.
● Источником инфекции являются животные (домашние, сельскохозяйственные, дикие).
● Факторы инфицирования – сырьё и продукты животного происхождения.
● Характерна природная очаговость.
● Характерна высокая инвазивность возбудителя (многие могут проникать через неповреждённую кожу).
● Реализуют все возможные механизмы и пути распространения.
● Может иметь место трансмиссивный механизм инфицирования.
● Человек не может быть источником инфекции для другого человека, организм человека – биологический тупик (единственное исключение - чума).
Francisella tularensis – очень мелкие, размером 0.2-0.7 x 0.2 мкм, полиморфные, кокковидные и палочковидные (в жидких средах) грамотрицательные бактерии. Спор не образуют. Жгутиков не имеют. Образуют капсулоподобное слизистое вещество. В мазках из жидких культур окрашиваются биполярно.
Факультативные анаэробы. Являются факультативными внутриклеточными паразитами. Чрезвычайно прихотливы, на простых питательных средах не растут. Для размножения требуется введение в среду цистеина как стимулятора роста. Культивирование возможно на питательных средах, содержащих яичный желток, печень, селезёнку, мозг, на кровяном агаре с добавлением глюкозы и цистеина. Оптимум температуры 36-37°C. На свёрнутой желточной среде образуют бесцветный, нежный налёт, колонии от 0.5 до 2 мм, гладкие, блестящие, беловатого цвета. На жидких средах размножаются хуже чем на плотных. Ферментативная активность мало выражена (расщепляют глюкозу и мальтозу до кислоты), биохимические свойства нестабильны. Оксидазоотрицательны, продуцируют сероводород.
Антигены. Содержат два антигенных комплекса: поверхностный Vi-антиген и соматический O-антиген. Вирулентные и иммуногенные свойства возбудителя связаны с Vi-антигеном. Вирулентные штаммы имеют колонии S-формы, R-формы утрачивают вирулентность.
Бруцеллы – мелкие, грамотрицательные коккобактерии размером 0.6-1.5 x 0.5-0.7 мкм. Жгутиков не имеют. Спор не образуют. Свежевыделенные штаммы могут образовывать нежную купсулу.
Бруцеллы требовательны к питательным средам. Для их культивирования используют специальные среды с добавлением сыворотки, крови, глюкозы, тиамина, биотина. Выделяемые из организма больных они размножаются очень медленно, рост может быть обнаружен только через 1-3 недели после посева исходного материала. Многократное пересевание в лабораторных условиях делает культуры способными расти в течение 1-2 дней. На плотных питательных средах бруцеллы образуют мелкие, выпуклые, бесцветные с перламутровым блеском колонии S-формы, которая легко диссоциирует в мукоидную и шероховатую. В жидких средах возникает равномерное помутнение. Под влиянием антибиотиков образуют L-формы.
Бруцеллы строгие аэробы. Brucella abortus в первых генерациях нуждается в повышенной концентрации (5-10%) CO2.
Биохимическая активность бруцелл характеризуется способностью расщеплять глюкозу и некоторые другие углеводы, разлагать мочевину и аспарагин, гидролизовать белок, пептоны, аминокислоты, выделять каталазу, гиалуронидазу, пероксидазу, липазу, фосфатазу и другие ферменты. Внутри видов бруцелл различают биовары. Их дифференциация основана как на биохимических различиях, так и на способности расти на средах с фуксином и тионином, лизабельности фагом T6, агглютинабельности моноспецифическими сыворотками.
Антигены. Бруцеллы содержат поверхностно расположенный Vi-антиген и соматические видоспецифические антигены A и M, количественное соотношение которых различно у разных видов. У Brucella melitensis преобладают M-антигены, у Brucella abortus и Brucella suis – A-антиген. Для идентификации бруцелл по антигенным свойствам используют реакцию адсорбции агглютининов по Кастеллани или монорецепторные сыворотки.
Bacillus anthracis – грамположительная, крупная (3-8 x 1-1.5 мкм) неподвижная палочка. В организме животных и человека, на питательных средах, содержащих кровь или сыворотку, сибиреязвенные бациллы образуют капсулу (белковой природы). В окрашенных препаратах бациллы, расположенные цепочками, выглядят обрубленными на концах, так что их цепи похожи на бамбуковую трость.
Спорообразование. В окружающей среде, главным образом в почве, куда попадает возбудитель с испражнениями, мочой больных или трупами животных, в присутствии кислорода и при температуре от 12 до 40°C образует овальные споры, не превышающие диаметр микробной клетки и расположенные центрально. В живых организмах споры не образуются. Нельзя вскрывать трупы животных, т.к. при доступе кислорода будут образовываться споры. Споры отличаются чрезвычайной устойчивостью к действию факторов окружающей среды (см. ниже), что позволяет им длительно сохраняться. Споры имеют основное значение при заражении животных в естественных условиях (загрязнённая спорами трава, водоёмы).
Культуральные свойства. Возбудитель сибирской язвы – аэроб или факультативный анаэроб. Хорошо размножаются на простых питательных средах. На поверхности агара через сутки образуются извитые, тяжистые, шероховатые колонии с неровными краями, напоминающие локоны, львиную гриву или голову Медузы Горгоны. Рост в бульоне характеризуется появлением белых хлопьев (похожих на комочки ваты), оседающих на дно пробирки, а сам бульон при этом остаётся прозрачным.
Посев уколом в столбик желатина выявляет характерную особенность роста в виде опрокинутой “ёлочки” – белый тяж с отходящими отростками, уменьшающимися книзу.
Биохимическая активность сибиреязвенных бацилл высока: помимо разжижения желатины, они гидролизуют крахмал, казеин, разлагают ряд углеводов (глюкозу, мальтозу и др.), восстанавливают нитраты.
Резистентность. Споры отличаются особенной стойкостью: в почве и воде могут сохранять жизнедеятельность десятилетиями (причём в почве они могут прорастать, размножаться и снова образовывать споры), дезинфицирующие вещества (5% раствор карболовой кислоты, 5-10% раствор хлорамина) убивают споры только через несколько часов действия. Споры термоустойчивы и выдерживают даже кипячение в течение 15-20 мин. Дубление и соление кож, мяса не уничтожает споры. Вегетативные формы обладают обычной для бактерий устойчивостью – гибнут при 55°C за 40 мин, при 60°C – за 15 мин, при кипячении – мгновенно.
Антигены. Сибиреязвенные бациллы имеют видовой антиген белковой природы, расположенный в капсуле, и групповой, соматический полисахаридной природы, локализованный в клеточной стенке микроорганизма. Соматический антиген термостабилен, не разрушается при кипячении.
Возбудитель чумы — J. pestis. Небольшая, овоидной формы палочка размером 1—2*0,3—0,7 мкм. Палочки полиморфны: они могут иметь нитевидную, шарообразную, колбовидную формы. Неподвижны, спор не образуют, имеют нежную капсулу. Грамотрицательны.
Хорошо окрашиваются всеми анилиновыми красками, наиболее интенсивно по полюсам — биполярно. Хорошо растут на простых питательных средах при рН 7,0—7,2 и температуре 28°С. Возможен рост и при более низких температурах (до 5°С), что помогает выделить микроб из загрязненного патологического материала. При росте в жидких средах образуются пленка с отходящими от нее нитями и хлопьевидный осадок. На плотных средах колонии по характеру роста вначале напоминают битое стекло; затем центр их уплотняется, окружается неровными фестончатыми краями в виде кружевного платочка. Характерно образование S (авирулентные) -и R (вирулентные)- форм колоний.
Биохимическая активность невелика. Сбраживает с образованием кислоты глюкозу, маннит, мальтозу, арабинозу и левулезу. Не разлагает глицерин и рамнозу, чем отличается от сходного с ним микроба — возбудителя псевдотуберкулеза у грызунов. Однако встречаются штаммы, ферментирующие глицерин. Протеолитическая активность выражена слабо: не разжижает желатин, не свертывает молоко. Продуцирует фибринолизин, коагулазу, гиалуронидазу и ряд других ферментов, определяющих патогенные свойства микроба. Обладает гемолитическими и фибринолитическими свойствами. Выделяет пестицины, которые относятся к бактериоцинам и оказывают токсическое действие на родственные микробы. Микроб образует токсические продукты, которые имеют свойства экзо- и эндотоксина и содержатся в теле и капсуле бактерий. Природа их изучена недостаточно. Вирулентность микроба зависит от наличия капсулы, VW-антигена, способности продуцировать пестицины, ферменты агрессии (гиалуронидаза, коагулаза, фибринолизин, гемолизин) и других факторов.
Устойчивость. Микроб довольно устойчив во внешней среде. Хорошо переносит низкую температуру, в замороженных трупах остается жизнеспособным в течение 7—12 мес. Прямой солнечный свет убивает его в течение 2—3 ч,
З 5% раствор карболовой кислоты — за 5—10 мин, 1—2% раствор хлорамина —за 1 мин. В гное сохраняется до 30 дней, в молоке —3 мес, в воде — до 50 дней.
Антигенная структура сложна и вариабельна. Имеются термолабильные капсульные специфцческие антигены и термостабильный соматический антиген, общий для рода пастерелл. У некоторых штаммов обнаруживают поверхностно расположенный VW-антиген, который препятствует фагоцитированию микробов в организме.
30. Микробиологическая диагностика и специфическая профилактика сибирской язвы.
Лабораторная диагностика проводится бактериоскопическим, бактериологическим, биологическим методами. Работа проводится в режимных лабораториях, так как сибирская язва – особая опасная инфекция.
● Бактериоскопический метод. Мазок, приготовленный из исследуемого материала, окрашивают по Граму и другими методами, выявляющими капсулу. Эффективным является применение капсульной люминесцирующей сыворотки.
Обнаруживают возбудителя также по характерной форме и расположению цепочками, но необходимо производить дифференциальную диагностику с Bacillus anthracoides.
● Бактериологический метод. Выделяют чистую культуру возбудителя посевами исходного материала в жидкие и на плотные питательные среды (мясопептонный агар). Идентификацию проводят по морфологическим, тинкториальным, культуральным (специфическая форма колоний на плотных средах и на желатине – см. выше) признакам, а также по лизабельности специфическим фагом и тесту “жемчужное ожерелье” (при лизабельности специфическим фагом на питательном агаре с пенициллином наблюдается превращение бактерий в протопласты в виде отдельных шаров (т.к. они теряют клеточную стенку), расположенных цепью – феномен “жемчужного ожерелья”).
При идентификации отсутствует пёстрый ряд, т.к. биохимическая активность очень вариабельна и поэтому не имеет диагностического значения.
Реакция термопреципитации специфической сывороткой по Асколи - выявляют сибиреязвенные антигены в различных материалах (трупах, коже, шерсти животных) – искомый антиген извлекают экстракцией при кипячении.
При взятии материала от погибших животных у них отрезают ухо (накладывают две лигатуры на ухо, между ними производится разрез, поверхности разреза прижигаются калёным железом, чтобы не допустить спорообразование). Категорически запрещается вскрывать трупы.
● Серологический метод: люминесцентносерологические реакции, термопреципитация по Асколи, реакция обратной непрямой гемагглютинации (с помощью эритроцитов, нагруженных антителами), иммуноферментный анализ.
● Биологический метод. Заражают лабораторных животных, готовят мазки-отпечатки органов.
● Аллергологический метод. Помимо лабораторных методов диагностики, возможна постановка аллергической пробы с антраксином. Положительной реакция становится в первые дни болезни и сохраняется в течение многих лет после выздоровления.
Для специфической профилактики можно применять вакцину СТИ (санитарно-технический институт) – взвесь живых спор авирулентных бескапсульных (S-формы) бактерий сибирской язвы. Вакцину вводят однократно накожно или подкожно, иммунитет создаётся на 1 год, при необходимости проводят ревакцинацию. Вакцинируют как животных, так и людей, по роду своей деятельности связанных с сельскохозяйственными животными или продуктами животноводства, представляющими потенциальную опасность заражения. При установленном контакте с источником возбудителя проводится экстренная профилактика, для чего вводят контактировавшим противосибиреязвенный иммуноглобулин и пенициллин.
31. Микробиологическая диагностика и специфическая профилактика чумы.
Чума относится к группе особо опасных инфекций, поэтому лабораторную диагностику заболевания производят в специальных противочумных лабораториях, режим работы которых регламентирован специальными инструкциями Министерства здравоохранения. Исследованию подвергают содержимое бубонов, кишечника, отделяемое язв, мокроту, кровь, материал вскрытия, блох, трупы грызунов и др.
Микробиологическая диагностика складывается из микроскопического, микробиологического, биологического и серологического методов исследования.
Микроскопия мазков, окрашенных по Граму, дает ориентировочное представление о наличии возбудителя чумы. При микробиологическом исследовании полученный материал засевают на мясо-пептонный агар или элективные среды с сульфитом натрия и генциановым фиолетовым, среду Филдса и выращивают при температуре 28—30°С в течение 24 ч. Подозрительные колонии подвергают дальнейшему изучению: определяют ферментативные свойства, фаголизабельность, вирулентность на морских свинках. Биологическая проба на животных имеет большое значение в случаях, когда исследуемый материал содержит небольшое количество чумных палочек или сильно загрязнен другими микробами. Патологический материал втирают в скарифицированную кожу нескольким морским свинкам или мышам. Животные погибают через 4—8 сут. Трупы их вскрывают, готовят мазки-отпечатки из разных органов и делают посевы на питательные среды.
Серологический метод имеет ограниченное применение. В последние годы ставят реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) с эритроцитарными диагностикумами. В качестве экспресс-метода используют реакцию преципитациц в геле, люминесцентно-серологический метод и реакцию нейтрализации антител (РНА). Для обнаружения чумного микроба во внешней среде применяют реакцию нарастания титра фага.
С целью специфической профилактики применяют живую вакцину, полученную из штаммов, потерявших вирулентность, но сохранивших иммуногенные свойства. После прививки иммунитет сохраняется около года. Ревакцинацию проводят через 6 мес. В настоящее время вакцинируют только лиц, которым угрожает опасность заражения: пастухов, охотников и работников сельского хозяйства в период эпизоотии, сотрудников противочумных учреждений.
Из антибиотиков для лечения чумы применяют биомицин и стрептомицин.
32. Микробиологическая диагностика и специфическая профилактика туляремии.
Лабораторная диагностика туляремии проводится серологическим методом.
Со 2-й недели заболевания определяют в сыворотке крови антитела в реакциях агглютинации и РНГА. При повторных исследованиях наблюдают нарастание титра антител.
Выделение возбудителя проводится в специальных режимных лабораториях. Выделить культуру посевом на среды обычно не удаётся. Поэтому исследуемым материалом (пунктат из бубона, соскоб из язвы, отделяемое конъюнктивы, налёт из зева, мокрота, кровь) заражают белых мышей или морских свинок. Животные погибают на 4-12-й день. Из их органов делают мазки-отпечатки и посев на свёрнутую желточную среду.
Антиген определяют постановкой реакции термопреципитации, в которой исследуемый материал – прокипячённая взвесь селезёнки и печени погибшего животного.
Ранним методом диагностики туляремии является постановка аллергических проб с тулярином. Проба становится положительной с 3-5-го дня заболевания.
Профилактика туляремии проводится в очагах распространения возбудителя. Помимо общих противоэпидемических мероприятий (борьба с грызунами, переносчиками), проводится иммунизация людей живой аттенуированной вакциной Гайского-Эльберта по эпидемиологическим показаниям. Эффективность этой вакцины высока, однократная накожная (или подкожная) вакцинация создаёт иммунитет на 5-6 лет. Профилактические мероприятия в природных очагах туляремии позволили существенно снизить заболеваемость этой инфекцией.
Для лечения туляремии применяют стрептомицин, тетрациклины и хлорамфеникол.
33. Микробиологическая диагностика и специфическая профилактика бруцеллёза.
Лабораторная диагностика проводится бактериологическим и серологическим методами.
Бактериологический метод. Материалом для бактериологического исследования на высоте лихорадки служат кровь, испражнения и моча больных, вне лихорадки – пунктат из лимфоузлов. Возбудителя можно выделить из костного мозга. Иногда исследуют спинномозговую жидкость. Выделением возбудителя занимается специальная режимная лаборатория с высоко квалифицированными специалистами.
● I этап. Делают посев материала в две колбы с печёночным бульоном, в одной из которых высокая концентрация CO2 (для Brucella abortus). В среду добавляют антифаговую сыворотку (т.к. большинство культур лизогенны и при смене условий обитания бактериофаг может активироваться). Наблюдения за сделанными посевами ведут 3-4 нед. Каждые 4-5 дней делают высевы и бактериоскопируют.
● II этап. Посев на среды накопления: печёночный агар + антифаговая сыворотка.
● III этап. Выделенную культуру идентифицируют, проводят биохимические тесты, пробу с фагом, биопробы (определение вирулентности), бактериостатический метод Хеддльсона (основан на различной способности микроорганизмов расти на средах с красителями), серологические реакции, определяют при этом биовары:
Аллергологический метод. Проба Бюрне - для постановки её используется бруцеллин (чаще проводится у животных). Положительным результат становится через 2-3 недели после заражения и остаётся таким в течение всего заболевания.
Серологический метод. Серодиагностику проводят с 10-12-го дня, когда появляются антитела.
● Реакция Хеддльсона – реакция агглютинации с неразведённой сывороткой – можно определить только наличие или отсутствие антител.
● Реакция Райта – развёрнутая (пробирочная) реакция агглютинации – можно определить титр антител.
● РСК, РНГА, иммунофлюоресценция, иммуноферментный анализ, радиоиммунный метод.
● Неполные антитела выявляют реакцией Кумбса и Винера.
После заражения обнаруживаются IgM, спустя неделю появляются IgG. При лечении титр IgG снижается, выздоровление может продолжаться недели и месяцы. При рецидиве (если симптомы появились вновь) обнаруживаются сразу IgG, при возникновении заболевания de novo сначала появляются IgM.
Серологические методы используются чаще, т.к. бруцеллёз – особо опасная инфекция, а при использовании серологических методов исключается непосредственный контакт с возбудителем.
Биологический метод. Заражаются мыши и морские свинки. Используется для определения вирулентности, выделения из органов возбудителя. Недостатки: длительность, возможность использования только в режимных лабораториях.
Вакцинацию проводят живой ослабленной бруцеллёзной вакциной, которую вводят животным планово, а также людям, подвергающимся опасности заражения. Для лечения используют стрептомицин, левомицетин, тетрациклин, эритромицин как этиотропные средства.