12.4.1 Гистологический анализ городских адаптаций
В городской и сельской среде в пределах предков мексиканской чечевицы мы сравнили гистологические изменения, связанные с дивергенцией клюва и местной адаптацией. Чтобы оценить активность BMP и последовательность развития возникновения, роста и созревания хрящевой кости, мы проанализировали срезы эмбрионов с использованием антифосфорилированного Smad1 / Smad5 / Smad8 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA; Ahn et al., 2001). Связывание BMP с рецепторами Ser / Thr киназы на клеточной мембране активирует рецепторы и впоследствии приводит к фосфорилированию белков Smad (Hogan, 1996; Young & Badyaev, 2007).
Нижнечелюстные зачатки больших клювов мексиканских чечевиц выделяли BMP раньше и на более высоком уровне, чем у чечевиц пустыни; городские и сельские птицы различались по активности BMP к 5-му эмбриональному дню (7 дней до вылупления, стадия E26 на рисунке 1.5a), и разница продолжала увеличиваться на протяжении всего онтогенеза. В целом, эмбрионы в городской популяции ускорили онтогенетические трансформации мандибул (зона I; рис. 1.5b) по сравнению с местной популяцией пустынь (Badyaev et al., 2008). Интересно, что не было различий в тканях скелета между популяциями. Наиболее значимым результатом было значительное изменение во времени экспрессии BMP4 между городскими и сельскими популяции (рис 1.5). BMP является повсеместным регулятором ремоделирования кости у позвоночных (Young & Badyaev, 2007); однако его участие на таких ранних стадиях развития предположительно недавней дифференциации населения было удивительным. Более поздние исследования, однако, подтвердили повсеместное повторное использование консервативных регуляторных факторов, включая BMP4, в онтогенезе клюва (rev. Badyaev, 2011a). Такая исключительная дифференциация по времени экспрессии консервативных регуляторов может позволить быструю реорганизацию развития клюва. Однако, чтобы точно установить, является ли этот паттерн распространенным среди других факторов роста и остаются ли генные функции постоянными, нам необходимо было упорядочить транскриптом развития клюва мексиканской чечевицы на начальных этапах адаптации к городской среде (Young & Badyaev, неопубликованная работа).
Рисунок 1.5. В городских условиях сильно ускоряется оссификация. Показана онтогенетическая трансформация ткани в нижней челюсти эмбриона в (а) сельских и (b) городских популяциях и относительных областях, занятых тканями на последовательных стадиях окостенения (зона I и зона II - на эмбриональных стадиях H & H). Звездочка показывает самый ранний возраст появления ткани. (c) Сильная сверхэкспрессия Bmp4 (среднее ± 1SE) в городских (белые столбцы) по сравнению с сельскими (черные столбцы) популяциями. После Бадяева и соавт. (2008).
12.4.2 Геномный анализ городских адаптаций: предварительные результаты
Мы извлекли и секвенировали РНК из эмбрионов из популяционных последовательностей, сосредоточив внимание на переходах между городом и деревней (например, рис. 1.1). В анализах RNAseq не всегда ясно, происходят ли гены с низким числом считываний от генов с низкой экспрессией или от транскрипционного шума (Hebenstreit et al., 2011; Wang et al., 2009) - например. как разделить экспрессированные и неэкспрессированные гены при низких значениях частотного распределения (рис. 1.6). Таким образом, мы использовали модель, которая рассматривает количество транскриптов, обнаруженных в исследовании RNA-seq, как смесь двух распределений - распределения Пуассона для транскриптов из неактивных генов и отрицательного биномиального распределения для транскрибируемых генов (Wagner et al., 2 012) Применение этой модели показало, что гены с более чем одним транскриптом на миллион транскриптов (TPM> 1) происходят из высокоэкспрессируемых генов (рис. 1.6). Мы использовали этот критерий для оценки и сравнения экспрессии генов в городской и сельской среде (рисунки 1.6 и 1.7).
Мы обнаружили, что, во-первых, для генов, экспрессируемых как в городских, так и в сельских популяциях, экспрессия в городской популяции была более ранней (подтверждающая ускоренное развитие там более крупных клювов, см. Раздел 12.4.1). Во-вторых, учитывая стадию развития, в новой сельской популяции было выражено гораздо больше генов, чем в исходной городской популяции, и эти гены были связаны с более широким спектром функций. Например, в городской среде, гены n = 6302 были экспрессированы на стадии 36 по сравнению с генами n = 5607 в сельской популяции на стадии 30 и генами n = 4618 в сельской популяции на стадии 25, включая n = 741 гены с высокой экспрессией, связанные с оссификацией, пролиферацией клеток, передачей сигналов Bmp и ответ на кортикостерон (рис.1.6, 1.7). Наконец, колонизация новой городской среды и начало новой локальной адаптации были связаны со значительно большим транскрипционным шумом, чем в исходной популяции (Рисунок 1.6, Young & Badyaev, неопубликованная работа).
Важно отметить, что разработка новой конфигурации клюва в городских условиях включала в себя не только известные скелетогенные гены, но также сочетание новых генов, которые часто различались между популяциями (Young & Badyaev, неопубликованные работы). Две группы генов позволяют рассмотреть особенно интересные идеи. Во-первых, гены, которые регулируют образование хряща, не различались между средами [например, в клюве и скелете экспрессия COL1A1 (фрибриллярный коллаген), EXT1 (передача сигналов фактора роста), Ihh (передача сигналов во время дифференцировки хондроцитов), MYOG (развитие скелетных мышц), BMP1 (формирование хряща)]. В то время как гены, которые были тесно связаны с окостенением, отличались больше всего [например, BMP4 (эндохондральный остеогенез, начало оссификации), CDH11 (экспрессируется в клетках остеобластов, активируется во время дифференцировки остеобластов), RARG (дифференциация хондроцитов), TWIST1 (дифференциация остеобластов) и SPARC (выделение остеонектина остеобластами] индуцирует минерализацию.
Во-вторых, гены, связанные с реакцией на кортикостерон - гормон стресса (СТРЕСС на рисунках 1.6 и 1.7), были сверхэкспрессированы на начальных этапах колонизации городских районов. Это открытие особенно важно, потому что исходный уровень кортикостерона был повышен в новых городских поселениях и в новых условиях окружающей среды в целом (Young & Badyaev, неопубликованная работа). Кроме того, из-за общих регуляторных путей между синтезом кортикостерона и продукцией BMP реакция на стресс может способствовать оссификации и росту в новых экологических условиях (Badyaev et al., 2006).
Таким образом, наши предварительные результаты секвенирования РНК подтвердили предыдущие наблюдения удивительного участия консервативных регуляторных факторов на самых ранних стадиях расхождения и в взаимодействии функций генов. Мы обнаружили значительную взаимозаменяемость функций генов в новых условиях при учете резких модификаций клювов во время эволюции адаптации к городской среде.
Рисунок 1.6. Отличительные профили RNA-seq зародышей при создании новоq сельской популяции из городской популяции (между рядами) и онтогенетических изменений в городских (верхний ряд) и сельских (нижний ряд) популяциях. Показано распределение частот транскрибированных и нетранскрибированных генов и величины экспрессии в подмножестве высокоэкспрессируемых генов, вовлеченных в пролиферацию клеток (CELL), окостенение (OSS), передачу сигналов BMP (BMP) и скелетогенный ответ на кортикостерон (STRESS). В скобках указаны номера генов в каждой категории. Обратите внимание на четкие шкалы верхнего и нижнего графиков. Значения Tpm нормализуются как по длине гена (kbp), так и по количеству отображенных чтений (сумма сопоставленных необработанных чтений), что делает их сопоставимыми по генам, популяциям и стадиям развития.
Рисунок 1.7 Различия в экспрессии генов между исходной (городской) и новой (сельской) популяциями на одной и той же эмбриональной стадии (а) и между эмбриональными стадиями в исходной городской популяции (b) для подмножества высокоэкспрессируемых генов, вовлеченных в пролиферацию клеток (CELL)), окостенение (OSS), передача сигналов BMP (BMP) и скелетогенный ответ на кортикостерон (STRESS) (на основании рисунка 12.6). Обратите внимание на многочисленные изменения экспрессии генов при переключении между городской и сельской средой. Внутри групп гены отсортированы по величине экспрессии.