Введение
Человечество вошло в третье тысячелетие с большим запасом знаний в области наук о жизни и колоссальным потенциалом их практического использования. Современный человек может произвольно и направленно изменять наследственность окружающего его живого мира - бактерий, растений, животных и человека. Появились беспрецедентные возможности технологического прогресса (биотехнология и биоинженерия), открывшего также новые пути в медицине (генная терапия) и сельском хозяйстве (трансгенные, или генетически модифицированные, растения и животные). Все это возникло на базе революционных прорывов в фундаментальной науке (молекулярная биология), которые затем и породили биотехнологическую революцию.
Эпохальным открытием молекулярной биологии нашего века стал предложенный в 1983 г. американским исследователем Кэрри Б. Маллисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской премии в 1993 г., альтернативный метод анализа геномной ДНК - метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР дает возможность в течение дня из одной молекулы ДНК получить 100 млрд. сходных по структуре молекул и однозначно "увидеть" нужные участки, а затем проверить генетический материал, экстрагированный из исследуемого клинического образца, на наличие в его составе участка чужеродной или измененной генетической информации. "Эта реакция проста в исполнении: нужны лишь пробирка, несколько простых реагентов и источник тепла. Препарат ДНК, который необходимо копировать может быть чистым, а может представлять собой сложную смесь различных биологических веществ. В качестве источника ДНК подходит и человеческий волос, и биоптат ткани, и капля засохшей крови, обнаруженная на месте преступления, и мозг мумии, и даже тело мамонта, пролежавшего 40 000 лет в вечной мерзлоте. За годы, прошедшие со времени открытия полимеразной цепной реакции, она нашла применение во всех отраслях биологии: опубликовано более 1000 работ, в которых была использована эта реакция. Идея ее так проста, что, учитывая значение ПЦР для развития биологических исследований, многим теперь кажется невероятным, что никто не додумался до нее раньше, хотя уже много назад все необходимые для проведения этой реакции компоненты были доступны."
Актуальность данной работы состоит в том, что полимеразная цепная реакция (ПЦР) является уникальным методом диагностики, и преимущество ее в определении гриппа. Цель исследования: раскрыть понятие и механизм полимеразной цепной реакции. Объектом исследования является данные о ПЦР, предметом являются данные диагностики гриппа методом ПЦР. Задачи исслдеования: систематизировать существующую литературу по полимеразной цепной реакции, дать краткий обзор проблемы лабораторной диагностики гриппа, установить роль метода ПЦР, проанализировать существующие данные по этой проблеме.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Суть метода ПЦР. ДНК-полимераза
Полимеразная цепная реакция - экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты в биологическом материале. Такой процесс увеличения числа копий ДНК называется амплификацией. Копирование ДНК при ПЦР осуществляется специальным ферментом - полимеразой. ДНК-полимераза(Рис. 3) - фермент, участвующий в репликации (амплификации ДНК в живых организмах) ДНК. Ферменты этого класса катализируют полимеризацию дезоксирибонуклеотидов вдоль цепочки нуклеотидов ДНК, которую фермент "читает" и использует в качестве шаблона. Тип нового нуклеотида определяется по принципу комплементарности с шаблоном, с которого ведется считывание.
ДНК-полимераза добавляет свободные нуклеотиды к 3'-концу собираемой цепочки. Это приводит к удлинению цепочки в направлении 5'-3'. Ни одна из известных ДНК-полимераз не способна создать цепочку "с нуля": они в состоянии лишь добавлять нуклеотиды к уже существующей 3'-гидроксильной группе. По этой причине ДНК-полимераза нуждается в праймере - короткой последовательности нуклеотидов (чаще 20-25), комплементарной концевым участкам изучаемого гена - к которому она могла бы добавить первый нуклеотид. Праймеры состоят всегда из оснований ДНК и РНК, при этом первые два основания всегда РНК-основания. Праймеры синтезируются другим ферментом - праймазой. Еще один фермент - геликаза - необходим для раскручивания двойной спирали ДНК с формированием одноцепочечной структуры, которая обеспечивает репликацию обеих цепочек в соответствии с полуконсервативной моделью репликации ДНК.
Некоторые ДНК-полимеразы обладают также способностью исправлять ошибки во вновь собираемой цепочке ДНК. Если происходит обнаружение неправильной пары нуклеотидов, ДНК-полимераза откатывается на один шаг назад, исключает из неправильный нуклеотид из цепочки, затем вставляет на его место правильный, после чего репликация продолжается в обычном режиме.
Проведение ПЦР
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод амплификации ДНК, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определённую последовательность ДНК в миллиарды раз. Возможность получения огромного количества копий одного строго определённого участка генома значительно упрощает исследование имеющегося образца ДНК.
Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо соблюдение ряда условий. Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:
ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
Два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента. (Пара искусственно синтезированных олигонуклеотидов, имеющих, как правило, размер от 15 до 30 п. н., идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.)
Термостабильная ДНК-полимераза. Полимераза, используемая в ПЦР, должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов - Thermus aquaticus (Taq-полимераза) и другие.
Дезоксинуклеотидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.
Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции - pH, ионную силу раствора. Содержит соли, сывороточный альбумин.
Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если же используется прибор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.
Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата, побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата. Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию.
Для многократного увеличения количества копий исходной ДНК нужна цикличность реакции. Как правило, каждый из последовательно повторяющихся циклов ПЦР состоит из трех этапов:
. Денатурация, или "плавление" ДНК. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 - 96ºС (или до 98ºС, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 - 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой прием называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.
. Отжиг - связывание праймеров с матричной ДНК. Когда цепи разошлись, температуру медленно понижают, чтобы парймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается 50-65ºС. Время стадии - 20 - 60 секунд. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифичных продуктов (при заниженной температуре).
. Синтез (элонгация цепи). ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве "затравки". Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей и движется вдоль матрицы. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72ºС. Время синтеза зависит от типа ДНК-полимеразы и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7 - 10 минут.
В дальнейшем этапы денатурации, отжига и элонгации многократно повторяются (30 и более раз). На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается.
Все реакции проводят в пробирках, погруженных в термостат. Смена температурного режима и его поддержание осуществляется автоматически.
Чтобы понять, как именно происходит амплификация определенного сегмента ДНК в ходе ПЦР, нужно четко представить положение всех праймеров и комплементарных им последовательностей в амплифицируемых цепях в каждом раунде. В первом раунде каждая из новосинтезированных цепей имеет гораздо большую длину, чем расстояние от 3’ -гидроксильной группы ее праймера до концевого нуклеотида последовательности, комплементарной второму праймеру. Такие цепи называют "длинными матрицами", именно на них будет идти дальнейший синтез.
Во втором раунде двухцепочечную ДНК, состоящую из сходной и новосинтезированной (длинная матрица) цепей, опять подвергают денатурации, а затем отжигают с праймерами. Во время синтеза в этом раунде вновь синтезируются "длинные матрицы", а также некоторое количество цепей с праймером на одном конце и с последовательностью, комплементарной второму праймеру, на другом ("короткие матрицы"). Во время третьего раунда все гетеродуплексы, образовавшиеся ранее, одновременно подвергаются денатурации и отжигу с праймерами, а затем реплицируются. В последующих раундах "коротких матриц" становится все больше, и к 30-му раунду их число уже в 106 раз превышает число исходных цепей или "длинных матриц".
Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) теоретически возрастает пропорционально 2n, где n - число циклов реакции. На самом деле эффективность каждого цикла может быть меньше 100%, поэтому в действительности:
~ (1+E)n ,
где Р - количество продукта, Е - средняя эффективность цикла.
Число "длинных" копий ДНК тоже растет, но линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент. Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов.
ПЦР - высокочувствительный метод, поэтому при наличии в исследуемом образце даже ничтожного количества ДНК, случайно попавшей из одной реакционной смеси в другую, могут быть получены ложноположительные результаты. Это заставляет тщательно контролировать все используемые для ПЦР растворы и посуду.
Основные принципы подбора праймеров.
При создании ПЦР-тест-системы одной из основных задач является правильный подбор праймеров, которые должны отвечать ряду критериев:
. Праймеры должны быть специфичны. Особое внимание уделяют 3'-концам праймеров, т.к именно с них начинает достраивать комплементарную цепь ДНК Taq-полимераза. Если их специфичность недостаточна, то, вероятно, что в пробирке с реакционной смесью будут происходить нежелательные процессы, а именно, синтез неспецифической ДНК (коротких или длинных фрагментов). Она видна на электрофорезе в виде тяжелых или легких дополнительных полос. Это мешает оценке результатов реакции, т.к легко перепутать специфический продукт амплификации с синтезированной посторонней ДНК. Часть праймеров и дНТФ расходуется на синтез неспецифической ДНК, что приводит к значительной потере чувствительности.
. Праймеры не должны образовывать димеры и петли, т.е. не должно образовываться устойчивых двойных цепей в результате отжига праймеров самих на себя или друг с другом.
Cтадии постановки ПЦР