Перечень методов исследований, выполняемых в лаборатории




HLA-диагностика применяется для решения вопросов трансплантации костного мозга и органов, для диагностики наследственных заболеваний, ассоциированных с генами главного комплекса гистосовместимости (болезни Бехтерева, сахарного диабета, цилиакии, рассеянного склероза и др.), а также в диагностике некоторых форм бесплодия, связанных с особенностями HLA супругов.
HLA-типирование – это выявление разновидностей HLA у обследуемого. Наша лаборатория HLA-типирования осуществляет типирование для подбора пары донор-реципиент для трансплантации костного мозга (по I и II классу), типирование образцов пуповинной крови для банка пуповинной крови. У человека гены главного комплекса гистосовместимости локализованы на 6-й хромосоме и кодируют так называемые лейкоцитарные антигены – HLA, human leucocyte antigens – историческое название, обусловленное способом их идентификации. Различают два основных класса HLA: I – находится преимущественно на Т-лимфоцитах, II – преимущественно на В лимфоцитах. Для клинических задач подбора доноров при пересадке органов и ТКМ, проводят типирование локусов А, В и С HLA I класса и локусов DR, DQ и редко DP HLA II класса. На сегодняшний момент используют два способа определения антигенов HLA: 1) Серологический метод – с помощью стандартных антител по их реакции «антиген-антитело» на клетках B и T-лимфоцитах. 2) Молекулярно-генетический метод – с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Молекулярный метод HLA-типирования использует в настоящее время три основные технологии идентификации ДНК: 1) SSP, 2) SSO и 3) секвенирование. В нашей лаборатории используют молекулярно – генетический метод технологии генотипирования SSP и SSO. 1) SSP-HLA-типирование (Sequence Specific Primers) называется так потому, что искомые HLA участки ДНК «улавливаются» специфическими праймерами в процессе амплификации с использованием аллель-специфических праймеров, с последующей детекцией методом гель-электрофореза. На первом этапе необходимо выделить ДНК из исследуемого образца крови. Затем следует этап ДНК амплификации в термоциклере. Для SSP HLA-типирования ДНК раскапывается в лунки ПЦР планшета, каждая из которых содержит праймеры определенной специфичности. Количество лунок (ПЦР реакций), таким образом, определяется количеством типируемых локусов и количеством аллельный вариантов в каждом локусе. Так, например, для низкоразрешающего типирования локуса DR обычно определяют около 24 специфичностей (24 лунки ПЦР планшета). После амплификации ампликоны переносятся в лунки агарозного геля, где проводится электрофорез. В тех лунках, где специфичности праймеров совпали со специфическими участками ДНК мы видим полосу продукта в геле. По таблице интерпретации или при помощи программы, определяем какой HLA-аллели она соответствует. Основным достоинством SSP технологии нужно признать то, что можно осуществлять типирование как на низком так и на а высоком разрешении, определяя точечный аллельный полиморфизм (практически сравнимый с секвенированием). Основным недостатком SSP HLA-типирования является его низкая производительность. В 96-луночный термоциклер при низкоразрешающем типировании можно поместить только один образец (DR-локус – 24 пробирки, А локус – 24 пробирки, В локус – 48 пробирок). Время, затраченное таким образом на типирование одного образца, например, по А, В, DR от выделения ДНК до интерпретации результатов составит примерно 3 часа. За день, при хорошей организации, можно протипировать 2-3 человека. 2) SSO-HLA-типирование (Sequence Specific Oligonucleotide) название так же обусловлено принципом выявления HLA-специфичностей и включает этапы ПЦР с последующей детекцией путем гибридизации ампликонов с олигонуклеотидными зондами. Аналогично SSP технологии для SSO тоже необходима стадия выделения геномной ДНК, которая затем должна амплифицироваться. Однако амплификация образца происходит в одной ПЦР пробирке, т.е. никаких «специфических» HLA ампликонов мы пока не получаем, а получаем только общую геномную ДНК образца. Искомые специфичности улавливаются на следующем этапе – гибридизации, который, условно говоря, заменяет электрофорез в SSP технологии. Гибридизация представляет собой процесс связывания теперь уже специфических участков ДНК с олигонуклеотидными зондами, пришитыми на специальные нейлоновые полоски – стрипы. Несвязавшиеся участки ДНК отмываются, а конъюгированные фрагменты, соответствующие искомым HLA аллелям окрашиваются пероксидазой. Весь процесс гибридизации, окраски и интерпретации результатов полностью автоматизирован с помощью специального оборудования: мультиплексный проточный анализатор Luminex 200. Одним из несомненных достоинств SSO технологии является возможность ее автоматизации и большая пропускная способность. На этапе амплификации в термоциклер можно установить сразу от одной до 96 проб. Амплифицированная ДНК каждого образца переносится в лунки гибридизатора, куда предварительно раскладываются стрипы (1 стрип – 1 локус). Соответственно для низкоразрешающего HLA-типирования одного образца, например, по A, B, DR нужно 3 стрипа. SSO технология не позволяет проводить HLA-типирование на высоком разрешении. Максимальное разрешение от низкого к среднему. Поэтому для типирования на высоком разрешении нужно иметь в арсенале лаборатории систему для электрофореза. SSO-HLA-типирование незаменимо при создании криохранилищ пуповинной крови, регистров доноров костного мозга, крупных трансплантологических и онкологических центров.



Поделиться:




Поиск по сайту

©2015-2024 poisk-ru.ru
Все права принадлежать их авторам. Данный сайт не претендует на авторства, а предоставляет бесплатное использование.
Дата создания страницы: 2019-04-14 Нарушение авторских прав и Нарушение персональных данных


Поиск по сайту: