ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия
Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Кафедра Клинической лабораторной диагностики
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ДЛЯ ОБУЧАЮЩЕГОСЯ
К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ ДЛЯ АУДИТОРНОЙ РАБОТЫ
Тема: Методы исследования плазменного гемостаза.
Утверждена на кафедральном заседании
№ протокола _________-
«_»__________________2009 г
Зав. Кафедрой клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО КрасГМА Росздрава
К.м.н. доцент ________________Анисимова Е.Н.
Составитель:
Асс. кафедры________________Савченко Е.А.
Красноярск
Методические указания к практическому занятию «Методы исследования плазменного гемостаза »
Тема: Методы исследования плазменного гемостаза.
Практическое занятие для цикла профессиональной переподготовки
Значение темы (актуальность изучаемой проблемы).
Система гемостаза-одна из основополагающих систем организма, которая обеспечивает жизнедеятельность всех органов, поддерживает жидкое состояние крови. Знание принципов назначения и дозирования антитромботических препаратов, а также лабораторного контроля за антитромботической терапией необходимо как клиницистам, так и врачам лабораторной диагностики.
3. Цели обучения:
на основе теоретических знаний и практических умений обучающийся должен знать:
o Типы коагулометров, принцип их работы
o АЧТВ, принцип метода, интерпретация результатов
o Протромбиновый тест, принцип метода, интерпретация результатов
o Тромбиновое время, принцип метода, интерпретация результатов
o Фибриноген, принцип метода, интерпретация результатов
Уметь провести следующие тесты:
- АЧТВ
- Протромбиновое время с определение МНО, рассчитать % протромбина по Quick
- Тромбиновое время
- Определить фибриноген по методу Клаусса
Иметь навыки:
o Работы автоматическими и стеклянными пипетками
o Работы на оптико-механическом коагулометре АПГ-2 (Россия, Москва)
o Проведения базовых клоттинговых тестов в пробирках с использованием термостата ТПС
4. План проведения занятия:
1. Контроль исходного уровня знаний, умений
2. Самостоятельная работа курсантов: проведение базовых клоттинговых тестов АЧТВ, ПВ, ТВ, определение уровня фибриногена по Клаусу в пробирках с использованием термостата ТПС и коагулометра АПГ-2.
3. Итоговый контроль знаний – тест-контроль по теме занятия
4. Подведение итогов занятия
Самостоятельная работа.
Проведение базовых клоттинговых тестов АЧТВ, ПВ, ТВ, определение уровня фибриногена по Клаусу в пробирках с использованием термостата ТПС и коагулометра АПГ-2.
Вопросы для самоподготовки обучающихся.
Ø Основные этапы модифицированной теории свертывания, которая расширяет и дополняет каскадную теорию
Ø Роль тромбина в тромбообразовании
Ø Основные эффекты тромбина при взаимодействии с сосудистой стенкой
Ø АЧТВ-принцип метода
Ø Диагностическое значение: причины удлинения и укорочения теста
Ø Реактивы, используемые для постановки АЧТВ, чувствительность к гепаринотерапии, дефициту факторов, присутствию ингибиторов.
Ø Проведение коррекционных проб, оценка результатов.
Ø Протромбиновое время, принцип метода, способы выражения результатов
Ø Стандартизация тромбопластинов
Ø МНО, противопоказания для использования АНД
Ø Тактика при терапии АНД
Ø Риск кровоточивости при терапии АНД, способы коррекции кровоточивости
Ø Протромбиновая активность по Квику
Ø Интерпретация результатов протромбинового теста, нормальные значения.
Ø Тромбиновое время, принцип метода
Ø Интерпретация результатов, нормальные значения ТВ.
Ø Фибриноген по методу Клаусса, принцип метода
4.3. Итоговый контроль. Тестовые задания по теме:
Основные понятия и положения темы (наглядные формы – таблицы, схемы, алгоритмы)
Скрининговые тесты оценки плазменного звена гемостаза
Лабораторная диагностика нарушений системы гемостаза является одной из самых дорогостоящих в лабораторной практике. Поэтому чрезвычайно важно соблюдать этапность проведения тестов, исходить из клинических данных и анамнеза пациента.
На первом этапе для уточнения направленности нарушений необходимо провести тесты, отражающие состояние целых звеньев системы гемостаза. Поскольку в разных лабораториях при анализе гемостаза преследуются разные цели, перечень тестов, входящих в гемостатический скрининг для данной лаборатории, может отличаться от такового в других лабораториях. Однако существует набор тестов, традиционно называемых (и рекомендуемых) скрининговыми для диагностики состояния системы гемостаза. Обычно к ним относят определение времени кровотечения и несколько тестов, оценивающих состояние плазменного звена гемостаза, которые входят как основной компонент в понятие коагулограммы.
Наиболее полно этапность разработана для диагностики геморрагических нарушений.
Скрининговые тесты:
• Время кровотечения.
• Количество тромбоцитов.
• АЧТВ.
• Протромбиновое время (по Квику).
• Тромбиновое время
• Количественное определение фибриногена
Скрининговые тесты на состояние внутреннего и внешнего каскада активации протромбиназы позволяют выявлять нарушения со стороны факторов-субстратов, кофакторов, ингибиторов каскада свертывания, а также действие некоторых лекарственных препаратов или аутоантител. Основным тестом на состояние внутреннего каскада свертывания плазмы является АЧТВ, на состояние внешнего каскада - ПВ. Их диагностическое значение представлено в табл. 1.
Несмотря на то что в тестах АЧТВ и ПВ участвует большинство плазменных факторов, далеко не во всех случаях при патологии того или иного звена или действии лекарственных препаратов эти показатели меняются. Коагулограмма - это комплексный анализ по многим тестам, совокупность которых может позволить определить конкретную причину нарушения свертывания крови.
Клинико-диагностическое значение АЧТВ и ПВ Таблица 1
| Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) | Протромбиновое время (ПВ) |
| Оценка активности ВМК, прекаллекриина, факторов XII, XI, IX, VIII, V, протромбина и в некоторой степени содержания фибриногена | Оценка активности факторов VII, X, V, протромбина и в некоторой степени содержания фибриногена |
| Контроль за лечением гепарина | Контроль за лечением непрямыми антикоагулянтами (антагонистами витамина К) |
| Определение волчаночного антикоагулянта |
Концентрация фибриногена начинает влиять на результаты тестов при снижении ее ниже определенного порога.
Таблица 2
Все тесты по исследованию гемостаза имеют свои естественные ограничения, так как они только моделируют in vitro процесс свертывания крови, который происходит в живом организме. Для моделирования in vitro внутреннего пути свертывания служит тест определения активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ). В этом тесте все необходимые компоненты инициации внутреннего пути свертывания вносятся извне.
Во внешнем пути свертывания ключевое место отводится тканевому фактору - гликопротеину, связанному с мембранами и присутствующему во многих тканях. Внешний путь свертывания принято in vitro" моделировать тестом протромбинового времени, когда к исследуемой цитратной плазме, бедной тромбоцитами, добавляют тромбопластин, представляющий собой солевой экстракт тканей, содержащий тканевый фактор и фосфолипи-ды.
Завершает процесс свертывания так называемый общий путь. Активированный ф. Ха превращает неактивный протромбин в гиперактивный фермент тромбин, тромбин отщепляет от молекулы растворимого фибриногена 4 фибринопептида, оставшиеся мономе- ры ассоциируют в полимер фибрин, ф. XIII завершает процесс, образуя ковалентные связи внутри молекулы фибрина, что делает молекулу нерастворимой и резистентной к лизису.
Несмотря на простоту выполнения тестов, необходимо, чтобы полученные результаты были точными и воспроизводимыми, а для этого следует обращать внимание на особенности получения проб плазмы для анализа, на правильную работу с пробами, на условия хранение проб и на использование адекватных контролей и стандартов.
АКТИВИРОВАННОЕ ЧАСТИЧНОЕ ТРОМБОПЛАСТИНОВОЕ ВРЕМЯ (АЧТВ)
Тест АЧТВ является одним из самых информативных и самых распространенных скрининговых тестов, который чувствителен к дефициту всех факторов свертывания крови (кроме ф. VII), к гепарину, к специфическим ингибиторам (антитела к ф. VIII и IX) и к неспецифическим ингибиторам (системная красная волчанка).
Внутренний путь свертывания осуществляется внутри кровеносных сосудов при повреждении эндотелия или при появлении чужеродной отрицательно заряженной поверхности. Процесс внутреннего свертывания начинается с активации «факторов контакта»: ф. XII (Хагемана), прекалликреина и высокомолекулярного кининогена, которые связываются с коллагеном, базальной мембраной эндотелия или с отрицательно заряженной чужеродной поверхностью, образуют комплекс и взаимно активируют друг друга, что выражается в изменении молекулярной структуры каждого компонента. При этом прекалликреин превращается в калликреин, неактивный ф. XII - в ф. ХIIа. Активный ф. ХIIa в присутствии своего кофактора, высокомолекулярного кининогена, превращает ф. XI в ф. ХIа, который в свою очередь воздействует на ф. IX, переводя его в ф. IХа. Ф. IХа, вместе с ф. VIIIa, фосфолипидами и ионами кальция образуют комплекс, который активирует ф. X и запускает процесс свертывания крови по общему пути.
В плазме крови имеются все вещества, которые необходимы для осуществления внутреннего пути свертывания: отрицательно заряженная поверхность (коллаген повреж денной сосудистой стенки), фосфолипиды (тромбоциты), циркулирующие неактивные факторы и кофакторы.
Метод моделирования процесса внутреннего свертывания в системе in vitro был предложен в 1953 г. (Langdell, Wagner, Brinhous) и первоначально осуществлялся на стеклянной поверхности. Однако стекло активировало процесс по-разному в зависимости от марки, методов обработки, применяемого моющего средства. С целью стандартизации в качестве активатора (отрицательно заряженной поверхности) стали использовать каолин, целит, бентонит и ряд других веществ с отрицательно заряженной поверхностью, в последние годы - растворимую в воде эллаговую кислоту. При проведении теста используют также фосфолипиды растительного и животного происхождения или их смесь и ионы кальция для рекальцификации плазмы после действия цитрата. С целью стандартизации реакцию проводят при постоянной температуре (37°С).
Принцип метода. Определяется время свертывания плазмы крови человека в условиях стандартизированной контактной и фосфолипидной активации процесса в системе in vitro. В этих условиях время образования сгустка фибрина зависит только от активности факторов внутреннего и общего путей свертывания.
До настоящего времени в ряде лабораторий проводят 2 других аналогичных, но лишь частично стандартизированных теста:
ЧТВ (частичное тромбопластиновое время или кефалиновое время) и
АВР (активированное время рекальцификации или каолиновое время).
ЧТВ, кефалиновое время, определяют при добавлении в исследуемую плазму фосфолипидного компонента (кефалина) и кальция хлористого; АВР, коалиновое время, - при добавлении в исследуемую плазму фактора контакта (каолина) и кальция хлористого, тест чувствителен к волчаночному антикоагулянту.
Тест АЧТВ не имеет стандарта ВОЗ, так как для его проведения применяют различные реагенты. В качестве заменителя тромбоцитарного фактора 3 используют тромбоциты, фосфолипиды животного происхождения (мозг кроликов, быка или человека), растительные фосфолипиды (сои), смесь растительных и животных фосфолипидов, фосфолипиды из мембран эритроцитов человека: эрилид, эритрофосфатид. АЧТВ-реагенты различаются также по типу и концентрации активатора, типу буфера, присутствию защитных добавок. Было установлено, что именно фосфолипидные реагенты являются тем компонентом, который преимущественно влияет на результаты АЧТВ-теста, и оптимальными являются те реагенты, в которых соотношение фосфатидил-серина и фосфатидилхолина такое же, как в факторе 3 тромбоцитов.
-Учитывая, что главная функция теста АЧТВ - провести скрининг нарушений внутреннего пути свертывания, предпочтение следует отдавать реагентам, наиболее чувствительным ко многим нарушениям в системе гемостаза, в том числе к дефициту активности факторов внутреннего пути свертывания, к присутствию в плазме крови волчаночного антикоагулянта и гепарина.