Содействие восстановлению естественных зубов низкомолекулярными антагонистами GSK3
· Витор С.М. Невес,
· Ребекка Бэбб,
· ДхивьяЧандрасекаран и
· Пол Т. Шарп
Научные отчеты объем 7, Номер статьи: 39654 (2017) Цитируйте эту статью
· 221k Допуски
· 79 цитат
· 1416 Альтметрический
· МетрикиДетали
Абстрактный
Восстановление дентина, утраченного при глубоком кариесе в зубах, является рутинным и распространенным лечением, которое включает использование неорганических цементов на основе минеральных агрегатов на основе кальция или кремния. Такие цементы остаются в зубе и не разрушаются, и поэтому нормальный минеральный объем никогда полностью не восстанавливается. Здесь мы описываем новый биологический подход к восстановлению дентина, который стимулирует естественное формирование репаративного дентина за счет мобилизации резидентных стволовых клеток в пульпе зуба. Биоразлагаемые, клинически одобренные коллагеновые губки используются для доставки малых доз низкомолекулярных антагонистов гликогенсинтазыкиназы (GSK-3), которые способствуют естественным процессам репаративного образования дентина для полного восстановления дентина. Поскольку несущая губка со временем разрушается, дентин заменяет разрушенную губку, что приводит к полному износу. эффективный натуральный ремонт. Таким образом, этот простой и быстрый процесс восстановления естественного зуба потенциально может обеспечить новый подход к клиническому восстановлению зубов.
Введение
Дентин - это жизненно важный минерал в зубах, который вырабатывается высокоспециализированными мезенхимальными клетками, называемыми одонтобластами. Когда минерал зуба нарушается в результате травмы или инфекции (кариес), внутренняя клеточная мягкая ткань пульпы может подвергаться воздействию внешней среды и инфицироваться. Клиническое восстановление повреждений зубов в настоящее время включает использование минеральных агрегатов, которые используются для заполнения пространства в дентине, образовавшегося после удаления кариеса или травмы 1, 2, 3, 4, 5. Когда мягкая внутренняя ткань пульпы обнажается, активируется естественный процесс восстановления, который включает мобилизацию резидентных мезенхимальных стволовых клеток для дифференциации в новые одонтобластоподобные клетки, которые секретируют форму третичного (репаративного) дентина 6, 7, 8, 9. Полученный репаративный дентин образует тонкую полосу дентина (дентинный мостик), который служит для защиты пульпы от инфекции, герметизируя пульпу зуба от внешней среды. К сожалению, естественного репаративного образования дентина недостаточно для эффективного заживления крупных повреждений, таких как повреждения, связанные с потерей дентина после удаления кариеса, и поэтому искусственные минеральные агрегаты используются для пломбирования зуба и замены утраченного дентина.
Активация передачи сигналов Wnt / β-cat является немедленным ранним ответом на повреждение тканей и, по-видимому, важна для стимуляции клеточного восстановления во всех тканях 10, 11, 12, 13. Аксин 2 является негативным регулятором, а также нижестоящей мишенью этого сигнального пути. Ключевым цитоплазматическим компонентом передачи сигнала Wnt / β-cat является фермент, гликогенсинтаза-киназа 3 (GSK-3), который в отсутствие связывания лиганда / рецептора Wntфосфорилирует β-катенин и аксин, что приводит к убиквитинированию и деградации. В присутствии лигандовWnt активность GSK-3 ингибируется, позволяя β-катенину проникать в ядро, где он взаимодействует с факторами транскрипции Lef / Tcf, чтобы регулировать экспрессию генов-мишеней, включая Axin2 14. Впервые подтвердив, что экспрессия Axin 2 и, следовательно, передача сигналов Wnt / β-cat активируется после повреждения зубов, мы пришли к выводу, что добавление агонистов передачи сигналов Wnt может обеспечить эффективный способ стимулирования репаративного образования дентина и, таким образом, восстановления утраченного дентина после удаления кариеса с помощью естественных новый дентин (рис. S1). Были разработаны многочисленные низкомолекулярные ингибиторы киназыгликогенсинтазы 3 (GSK3), которые, как было показано, эффективно регулируют активность Wnt в различных экспериментальных контекстах, а в одном случае, тидеглусиб (NP-12, NP03112), проходят клинические испытания для лечения неврологические расстройства, такие как болезнь Альцгеймера 15, 16, 17, 18, 19,20, 21. Мы проверили способность трех низкомолекулярных ингибиторов GSK3: BIO (2′Z, 3′E) -6-броминдирубин-3′-оксим), CHIR99021 (6 - [[2 - [[4- (2,4-дихлорфенил)) -5- (5-метил-1H-имидазол-2-ил) -2 пиримидинил] амино] этил] амино] -3-пиридинкарбонитрил) и тидеглусиб (4-бензил-2- (нафталин-1-ил) - [ 1,2,4] тиадиазолидин-3,5-дион) для стимуляции третичного дентина после экспериментально индуцированного воздействия на пульпу 22, 23, 24. В качестве средства доставки мы использовали коммерчески доступную, клинически одобренную коллагеновую губку Kolspon.
Результаты
Эффективные концентрации и тестирование цитотоксичности
Клетки пульпы зуба мышей 17IA4 инкубировали с диапазоном концентраций трех ингибиторов и анализировали цитотоксичность с помощью анализа МТТ через 24 ч в культуре (рис. 1A – C) 25, 26. Наивысшую концентрацию ингибитора, который не был цитотоксичным, использовали в отдельных анализах с теми же клетками и уровнями Axin2, измеренными с помощью кПЦР в первые 24 часа культивирования. Повышенная экспрессия Axin2 наблюдалась через 30 минут и достигала максимума через 1 час (рис. 1D). BIO-индукция экспрессии Axin2 была в четыре раза выше, чем у CHIR99021 и Tideglusib, каждый из которых показал аналогичные уровни индукции (фиг. 1D).
Рисунок 1: Титрование лекарств и активация агонистами пути Wnt.
Анализ цитотоксичности МТТ для (A) BIO, (B) CHIR99021 и (C) тидеглусиба. (D) КПЦР Axin2 для анализа in vitro с клеточной линией 17IA4 показывает, что когда 50 нМ BIO, 5 мкМ CHIR и 50 нМтидеглусиб находятся в губке, активность Wnt увеличивается после 30 минут инкубации и остается повышенной. Это повышение не наблюдается, когда с клетками инкубируют только среду или коллагеновую губку без лекарственного средства. (E) Axin2 qPCR для клеток пульпы зуба, собранных либо без повреждений, либо после одного дня травмы и покрытия с условиями. BIO, CHIR и Tideglusib демонстрируют значительную повышающую регуляцию активности Wnt по сравнению с контролем, MTA или коллагеновой губкой. * P = 0,0365, **** Р <0,0001.
Полноразмерное изображение
Чтобы проверить индукцию Axin2 invivo, экспериментальное повреждение зубов было создано путем сверления и проделывания 0,13 мм отверстий в первых молярах верхней челюсти мыши, чтобы обнажить пульпу (рис. 2). Куски кольспона разрезали по размеру и пропитывали растворами трех ингибиторов перед физическим помещением в отверстия для контакта с пульпой. Стеклоиономерный цемент использовался для покрытия губки и защиты зуба (рис. 2G). Обработанные зубы были удалены через 24 часа вместе с контрольными, состоящими из необработанных зубов, только MTA и коллагеновой губки без ингибитора. Клетки пульпы были извлечены и протестированы на экспрессию Axin2 с помощью кПЦР (рис. 1E.). Экспрессия Axin2 была в 3 раза выше в обработанных ингибитором клетках пульпы по сравнению с контролем (фиг. 1E). Существенно, что MTA не оказывал влияния на экспрессию Axin2 по сравнению с контролями, предполагая, что текущие протоколы не приводят к усиленной активации передачи сигналов Wnt. Через 5 дней после обработки уровни экспрессии Axin 2 были такими же, как при лечении MTA и агонистами, но эти результаты были усугублены тем фактом, что вновь образующиеся odotonblast-подобные клетки экспрессируют высокие уровни Axin 2 (фиг. S1–2).
Рисунок 2: Травма и прямое перекрытие зуба.
(A) фотография верхних первых моляров. (B) Твердосплавный бор на 1/4 режет зуб, обнажая дентин до свода пульпарной камеры (красная пунктирная линия). (C) С помощью иглы обнажается пульпа зуба, как показано стрелками. (D) Коллагеновая губка пропитывается лекарством, и небольшой ее кусочек, обозначенный черной пунктирной линией, удаляется для прямого покрытия. (E) Травма, вызванная MTA. (F) Кусок губки уплотнился внутри обнаженной области пульпы. (G) Зуб затем запломбирован стеклоиономером до даты забора. (H) Изображение MicroCT сразу после покрытия, показывающее тесный контакт MTA (область обратного осмоса, указанная стрелкой) с пульпой зуба и стеклоиономерным уплотнением. (I) Изображение MicroCT сразу после покрытия, показывающее тесный контакт коллагеновой губки (область RL, указанная стрелкой) с пульпой зуба и стеклоиономерным уплотнением. ED - обнаженный дентин; EP, обнаженная пульпа; CS, коллагеновая губка; GI, стеклоиономер; РО, рентгеноконтрастный; РЛ, рентгенопрозрачный.