Обсуждение
Современная стоматологическая практика при кариозных поражениях направлена на удаление кариеса и восстановление структуры зуба с помощью минеральных заполнителей. Сохранение неповрежденного дентина является неотъемлемой частью этой практики, поскольку сохранение как можно большего количества природных минералов считается важным для жизнеспособности зубов. Сообщается, что минеральные агрегаты, такие как MTA и биодентин, способствуют формированию третичного дентина, хотя отложение этого дентина происходит не в местах повреждения, а внутри пульпы 27, 28, 29. Кроме того, биологически не разлагаемая природа этих материалов означает, что полный минеральный объем никогда не восстанавливается. Если можно будет разработать простой метод, который будет усиливать естественные процессы восстановления дентина путем стимуляции формирования третичного дентина, то большие травмы, которые, безусловно, могут привести к некрозу пульпы зуба, можно будет исправить, позволив репаративному дентину сформироваться на месте повреждения. повреждать. Активация передачи сигналов Wnt / βCat в качестве универсального немедленного раннего ответа на повреждение ткани обеспечивает потенциальный путь для усиления естественного восстановления за счет чрезмерной стимуляции этого пути 30. Таким образом, передача сигналов Wnt / βcatenin стала основной мишенью для регенерации и восстановления тканей, и активность этого пути может быть стимулирована множеством различных способов. Мы выбрали низкомолекулярные агонисты как простой и экономичный метод, который подтверждается значительными существующими экспериментальными данными и клиническим применением. В нашей системе модели повреждений мы не наблюдали каких-либо эффектов MTA на усиление активности передачи сигналов Wnt, и, хотя он может действовать другими путями, кажется вероятным, что любое положительное действие на минерализацию является результатом предоставления минеральных ионов. Мы разработали метод, который использует уже клинически одобренный биоматериал (коллагеновая губка - Kolspon) в качестве средства доставки для низкомолекулярных ингибиторов GSK-3, которые действуют как агонисты Wnt.15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Поскольку повышенная активность Wnt в ответ на повреждение является немедленным ранним ответом, мы стремились достичь быстрого высвобождения низкомолекулярных агонистов и пришли к выводу, что губка является наиболее эффективным способом обеспечения этого. Все три агониста показали значительно повышенную минерализацию в месте повреждения по сравнению с использованием одной губки или лечения МТА. Более того, локализация образовавшегося репаративного дентина указала на то, что в ходе лечения минерал заменил биоразлагаемую губку и восстановил полость в дентине, образованную фрезой. При использовании MTA полость остается постоянно заполненной минеральным заполнителем, и этот неразлагаемый материал может влиять только на формирование репаративного дентина на поверхности пульповой камеры.
Важным фактором является эффект, который агонисты Wnt могут оказывать после их высвобождения в кровоток. Используемые небольшие локализованные дозы этих агонистов были эффективны в увеличении образования репаративного дентина до такой степени, что почти полное заживление поражения наблюдалось через 6 недель. Эти дозы существенно ниже, чем те, которые использовались в клинических испытаниях тидеглусиба, когда 500–1000 мг вводились систематически ежедневно в течение 26 недель 20.. Мы использовали максимум 21 пгтидеглусиба на губках, и, таким образом, даже если 100% препарата на губке высвободится в течение нескольких часов, максимальная системная концентрация, предполагая, что все лекарство попадает в кровоток, будет не более 21 пг в 1,5 мл. Объем крови мыши примерно в 3000 раз меньше, чем у человека, и, таким образом, дозировка мыши в кровотоке эквивалентна 63 нг в кровотоке человека, что в 1000 раз меньше, чем использовалось в клинических испытаниях. Экстраполяция размера первого моляра мыши на размер человека позволяет предположить, что эквивалентное поражение потребует примерно в 10 раз больше репаративного образования дентина, и, таким образом, ожидаемые концентрации тидеглусиба, необходимые для восстановления зубов человека, будут значительно ниже тех, которые уже были протестированы в клинических испытаниях.
Низкомолекулярные сигнальные агонисты Wnt, доставляемые через биоразлагаемую коллагеновую губку, обеспечивают эффективное восстановление экспериментально вызванных глубоких поражений зубов за счет стимулирования репаративного образования дентина. Простота этого подхода делает его идеальным для применения в клинических стоматологических продуктах для процедур, требующих восстановления дентина и защиты пульпы, которые в настоящее время обрабатываются неорганическими цементами.
Материалы и методы
Дизайн исследования
Целью этого исследования было выяснить, можно ли улучшить естественное восстановление дентина за счет стимуляции образования репаративного дентина. Были использованы первые моляры взрослых мышей CD1 дикого типа, и повреждение стимулировали контролируемым сверлением (см. Ниже). Выбранные препараты и носитель были основаны на предыдущих сообщениях в литературе, а также на их потенциале преобразования в простую и экономичную стоматологическую терапию.
Чтобы оценить репаративную способность лекарств, оценивали от шести до девяти зубов для каждой временной точки, а для анализа экспрессии генов invivo использовали выборку размером 20-30 зубов на группу. Временные точки репарации, использованные в этом исследовании, соответствовали правилам Министерства внутренних дел Великобритании о животных. Это исследование не было слепым, и выборка не была случайной.
Протокол травм
Со всеми животными, использованными в этом исследовании, обращались в соответствии с лицензией на проект 70/7866 Регламента Министерства внутренних дел Великобритании и личной лицензией I6517C8EF. Экспериментальные процедуры были одобрены процессом этической экспертизы Королевского колледжа. Мышей анестезировали раствором, приготовленным из Hypnorm (фентанил / флуанизон - VetaPharmaLtd.), стерильной воды и Hypnovel (Midazolam - Roche) в соотношении 1: 2: 1 из расчета 10 мл / кг внутрибрюшинно. Закругленный карбидный бор FG 1/4, соединенный с высокоскоростным наконечником, использовался для доступа к дентину верхних коренных зубов мыши. Как только заусенец обнажил дентин, использовали иглу 30G для проникновения в пульпу. Чтобы защитить пульпу от внешнего загрязнения и стимулировать восстановление дентина, травма была закрыта либо агрегатом триоксида минерала ProRoot (MTA) (MaillferDentsply), либо или Кольспон (FishCollageType 1 - EucareLtd) отдельно или в сочетании с 50 нМ BIO (SIGMA), 5 мкМ CHIR99021 (SIGMA) или 50 нМTideglusib (SIGMA), растворенными и разбавленными в ДМСО, при контакте с пульпой. Слой 3 M Ketac-CemRadiopaque использовали в качестве покрывающего материала для герметизации поврежденного участка. Повреждение было выполнено на двух верхних первых молярах. Для повреждения резца через нижний зуб мыши в пульпу вводили тонкую иглу. После операции мышам вводили Ветергезик (бупренорфин - цева) из расчета 0,3 мг / кг внутрибрюшинной инъекцией в качестве анальгетика. Животных умерщвляли через 1 день, 4 недели и 6 недель. Слой 3 M Ketac-CemRadiopaque использовали в качестве покрывающего материала для герметизации поврежденного участка. Повреждение было выполнено на двух верхних первых молярах. Для повреждения резца через нижний зуб мыши в пульпу вводили тонкую иглу. После операции мышам вводили Ветергезик (бупренорфин - цева) из расчета 0,3 мг / кг внутрибрюшинной инъекцией в качестве анальгетика. Животных умерщвляли через 1 день, 4 недели и 6 недель. Слой 3 M Ketac-CemRadiopaque использовали в качестве покрывающего материала для герметизации поврежденного участка. Повреждение было выполнено на двух верхних первых молярах. Для повреждения резца через нижний зуб мыши в пульпу вводили тонкую иглу. После операции мышам вводили Ветергезик (бупренорфин - цева) из расчета 0,3 мг / кг внутрибрюшинной инъекцией в качестве анальгетика. Животных умерщвляли через 1 день, 4 недели и 6 недель.
Анализ цитотоксичности
Клетки 17IA4 помещали в 96-луночные планшеты при 20000 клеток / см 2 и инкубировали (37 ° C, 5% CO 2./ 95% воздуха, 100% влажности) в течение 24 часов с использованием стандартной питательной среды. После этого среду заменяли кондиционированной (лекарства + среда) и контрольной средой (только среда) еще на 24 часа. (10 мкл препарата в ДМСО + 90 мкл среды, что дает следующие концентрации BIO: 200, 100, 50 нМ; CHIR99021: 10, 8, 5 мкМ; Тидеглусиб: 200, 100, 50 нМ). Для определения метаболической активности клеток через 24 часа к контролю и кондиционированной среде добавляли МТТ (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид, Sigma). Полученный продукт формазан затем растворяли в 200 мклдиметилсульфоксида на лунку (ДМСО, Sigma). Колориметрический планшет-ридер (микропланшетныйридерThermoMultiskanAscent 354) использовали для считывания оптической плотности при 540 нм с вычитанием фона при 630 нм.
Высвобождение лекарств invitro
Клетки 17IA4 помещали в 24-луночные планшеты и инкубировали (37 ° C, 5% CO 2 /95% воздух, 100% влажность) в течение 24 часов с использованием стандартной культуральной среды. Вкладыши для клеточных культур Falcon TM для использования с 24- луночными планшетами (размер пор 3 мкм) помещали в лунки, содержащие кубики Кольспона 96 мм 2, сухие или пропитанные 30 мкл оптимальной концентрации препарата на 15 и 30 минут, 1, 6, и 12 часов. Клетки собирали с помощью TRIzol и хранили при -20 ° C.
Сбор целлюлозы
Мышам P21 просверливали верхние первые моляры в соответствии с протоколом сверления. Ткань пульпы зуба собирали в соответствии с графиком эксперимента после травмы. Верхние первые моляры были извлечены с использованием иглы 21 G в качестве подъемника для их подъема из альвеолярной кости, а извлеченные коренные зубы были сохранены в ледяном PBS. С помощью лезвия скальпеля 23 коренные зубы были разделены в месте соединения коронка-корень, чтобы можно было визуализировать пульповую камеру. Пинцетом с прямым кончиком диаметром 0,6 мм осторожно соскребали пульпу с пульпарной камеры и корневого канала. Затем пульпу помещали в холодную SigmaRNAlater и хранили при -80 ° C.
Q-ПЦР
РНК экстрагировали из клеток в культуре с лекарствами через 15, 30 минут, 1, 6 и 12 часов, а также из пульпы зуба, взятой у мышей дикого типа CD1 P21 без повреждений (контроль) и через 1 день после травмы при применении ТРИЗола. (ThermoFisherScientific) в соответствии с рекомендациями производителя. РНК количественно определяли с помощью Nanodrop и обратно транскрибировали в кДНК. Бета-актин использовался в качестве гена домашнего хозяйства (Forward-GGCTGTATTCCCCTCCATCG, Reverse-CCAGTTGGTAACAATGCCTGT), а Axin2 считывал активность пути Wnt (Forward-TGACTCTCCTTCCAGATCCCA, Reverse-TGCCACCACACTAGGCTGCTGTGTG).
MicroCT / анализ минералов
Верхние моляры мышей иссекали и фиксировали 4% PFA в течение ночи и сканировали с помощью сканера микро-CT Bruker Skyscan1272. После сканирования для визуализации и анализа использовалась программа Microview (GE). Двумерные (2D) изображения были получены из изображений поперечного сечения верхней внутренней части первого моляра с помощью микро-КТ, чтобы оценить, было ли бурение успешным и образование минералов. Для анализа содержания минералов в тканях ROI X = 0,2 мм, Y = 0,4 мм и Z = 0,2 мм был установлен в качестве стандарта для всех образцов, и был проведен минеральный анализ. Измеряемая область включала только место повреждения. ROI в комплекте с минералом = 0,0017 мг.
Гистология
После 4 недель декальцификации в 19% EDTA зубы были вложены в восковые блоки и сделаны срезы толщиной 8 мкм. Срезы окрашивали трихромомМассона.
окрашивание β-галактозидазой
Зубы фиксировали в 0,4% параформальдегиде (PFA) в течение 24 часов при 4 ° C, промывали PBS и декальцинировали в 19% EDTA, pH 8, в течение 4 недель. Зубы погружали в 30% сахарозу / PBS на ночь при 4 ° C перед погружением в OCT (оптимальная температура среза) с использованием сухого льда и этанола. Срезы нарезали толщиной 12 мкм и повторно фиксировали (0,2% глутарового альдегида, 0,2% NP40, 5 мМ EDTA, 2 мМMgCl 2 в PBS) и промывали в промывочном буфере (2 мМMgCl 2, 0,02% дезоксихолата натрия, 0,02%). % NP40 в PBS). Окрашивание β-галактозидазой визуализировали с использованием окрашивающего раствора 1 мг / мл субстрата X-gal (Invitrogen) в промывочном буфере, содержащем 5 мМферроцианид калия и феррицианид калия, при 37 ° C в течение 16 часов. Срезы были обезвожены, очищены Neo-Clear и закреплены с помощью Neo-Mount.