Морфология и тинкториальные свойства

Мазки из патматериала окрашивают по Граму и одному из следующих специальных методов: по Козловскому, модифицированному методу Циль-Нильсена (по Стампу) или Шуляку-Шину. При микроскопии мазков учитывают, что бруцеллы – мелкие, грамотрицательные, расположенные отдельно, попарно или кучно коккобактерии, окрашивающиеся по модифицированному методу Циль-Нильсена, Козловскому или Шуляку-Шину в красный цвет. Другие микроорганизмы – в синий или зеленый цвет.

Рис. 3 Brucella melitensis в мазке из патологического материала окрашиваются по Козловскому в красный цвет, остальная микрофлора и клетки ткани – в синий цвет

Культуральные свойства. Для культивирования бруцелл используют мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), печеночный глюкозо-глицериновый бульон (ПГГБ), мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (МППГГА), печеночный глюкозо-глицериновый агар (ПГГА), картофельный агар, эритрит-агар, сывороточно-декстрозный агар, печеночно-сывороточный агар и печеночно-аминопептидный агар. Из каждого органа делают посев на 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром.

Характерной особенностью представителей рода Brucella является медленный рост на питательных средах, особенно в первых генерациях.

При посевах крови, костного мозга и мочи культуры бруцелл обнаруживаются через 5–10 дней, а иногда через 20–30 дней после посева. При этом первые генерации культур В. abortus и В. ovis способны расти только при наличии в атмосфере повышенного содержания углекислого газа (5–10 %). В. abortus 5-го, 6-го и 7-го биоваров могут расти в обычных аэробных условиях.

Начиная с четвертого дня после посева, флаконы просматривают и при отсутствии роста культуры поверхность агара орошают бульоном. При положительном результате на поверхности агара появляются колонии бруцелл. Если в течение месяца бруцеллы не обнаруживаются, то в этом случае делают контрольный высев из бульона на твердую питательную среду.

На поверхности агара бруцеллы образуют мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью просвечивающиеся колонии, имеющие в отраженном свете голубоватый оттенок, в падающем свете – сероватый. С возрастом колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента. В бульоне бруцеллы образуют равномерное помутнение и пристеночное кольцо, возвышающееся над уровнем бульона, а в дальнейшем небольшой осадок на дне пробирки. В отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.

Рис. 4 Колонии Brucella на плотной питательной среде

Выделенные культуры идентифицируют по тинкториальным (окраска мазков по Граму и одним из специальных методов – по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину), морфологическим, культуральным свойствам и в реакции агглютинации на стекле с использованием набора компонентов для серологической дифференциации бруцелл. А также по способности роста в отсутствии повышенной концентрации углекислого газа, выделению сероводорода, чувствительности к фагу Тб, бактериостатическому действию анилиновых красителей. Можно применять люминесцентную микроскопию, методы ПЦР, ИФА.

Проба со специфической сывороткой. Для предварительной, быстрой идентификации культуры ставят реакцию агглютинации на стекле. На предметное стекло наносят каплю бруцеллезной поливалентной сыворотки (R и S-сыворотки), разведенной 1: 25 0,9%-м раствором натрия хлорида, в которой эмульгируют одну петлю исследуемой культуры. В положительных случаях быстро (в течение 1 мин) наступает агглютинация с образованием хорошо выраженных хлопьев, в отрицательных – суспензия остается гомогенной. Для контроля исследуемую культуру эмульгируют в капле нормальной кроличьей сыворотки или 0,9%-м растворе натрия хлорида.

Учет реакции проводят по следующей схеме:

++++ (4 креста) - полное просветление жидкости с образованием четко

выраженного агглютината - положительная реакция;

+++ (3 креста) - неполное просветление жидкости с выраженным

агглютинатом - положительная реакция;

++ (2 креста) - неполное просветление жидкости со слабо выраженным

агглютинатом - положительная реакция;

+ (1 крест) - жидкость без просветления с едва заметным агглютинатом

- сомнительная реакция;

- (минус) - просветление жидкости не наступило, смесь гомогенная - отрицательная реакция.

Реакция считается положительной на бруцеллез при агглютинации на 2 креста.

Таблица 1 – Дифференцирующие признаки видов и биоваров бруцелл

Биопроба. Для выделения бруцелл из материала, загрязненного посторонней микрофлорой, и при малой концентрации бруцелл в исследуемом материале используются морские свинки или белые мыши. Исследуемый материал вводят подкожно в паховую область в дозах не более 0,5 мл для мышей и 1 мл для морских свинок. Вскрытие белых мышей проводится через 20–25 дней, морских свинок – через 30–35 дней после введения исследуемого материала. Перед вскрытием у свинок следует взять кровь из сердца для исследования сыворотки в реакции агглютинации на наличие специфических антител.

На 15, 25 и 40-е сутки после заражения у морских свинок берут кровь. Сыворотку крови исследуют в пробирочной РА в разведениях от 1:10 до 1:80.

При положительной реакции агглютинации в разведении 1:10 и выше морских свинок убивают. В случае необходимости получения культуры возбудителя материал от них исследуют бактериологически. При отрицательной РА у морских свинок в указанные выше сроки биопробу считают отрицательной, подопытных животных убивают, бактериологическое исследование не проводят.

Серологические методы. Серологическая диагностика бруцеллеза проводится ежегодно на всем поголовье животных и заключается в обнаружении специфических антител в сыворотке крови животных в реакции агглютинации (РА) в пробирках, реакции связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК), реакции иммунодиффузии с 0-полисахаридным антигеном (РИД), пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба – РБП).

РБП проводят с бруцеллезным антигеном, окрашенным бенгальским розовым, на пластинах с лунками. При положительной реакции в течение 4 мин появляются мелкие или крупные хлопья агглютината розового цвета.

РА ставят с единым бруцеллезным антигеном для РА, РСК, РДСК. РА считают положительной при наличии агглютинации с сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов, начиная с разведения 1:100 (100 МЕ); овец, коз, буйволов, оленей и собак – с 1:50 (50 МЕ) с оценкой не менее двух крестов.

Рис. 5 Результаты роз бенгал пробы (РБП)

Аллергический метод. Метод аллергического исследования основан на выявлении у больных бруцеллезом животных повышенной чувствительности замедленного типа к специфическому аллергену (бруцеллину). Аллергический метод применяют для исследования на бруцеллез крупного рогатого скота, буйволов, овец, коз, свиней и северных оленей, не подвергавшихся прививке вакцинами против бруцеллеза, проводится для уточнения результатов серологии. У овец и коз применяют пальпебральную пробу, свиньям препарат вводят внутрикожно с наружной стороны ушной раковины. У больных животных на месте введения развивается воспалительная реакция.

Исследование молока на бруцеллез. Кольцевая реакция (КР) применяется с целью ориентировочной проверки благо­получных по бруцеллезу молочных стад и для проверки молока на рынках. Сущность кольцевой реакции заключается в том, что в молоке бруцеллезных животных при добавлении антигена образуется комплекс антитела с антигеном, который адсорбируется жировыми частицами молока. Жировые частицы вслед­ствие своего малого удельного веса поднимаются наверх, увлекая адсорбиро­ванный агглютинат, который в зависимости от цвета антигена образует на по­верхности жидкости окрашенное кольцо. Положительная реакция – белое молоко, синие сливки. Отрицательная реакция – синее молоко, белые сливки.

Рис. 6 Положительная проба на бруцеллез в кольцевой реакции

ДИАГНОСТИКА ТУЛЯРЕМИИ

Патологический материал для лабораторного исследования. Для исследования направляют отловленных диких мелких млекопитающих или их трупы, собранные в природе, подснежные гнезда грызунов, продукты жизнедеятельности мелких млекопитающих, погадки птиц, помет хищных млекопитающих, а также солому, мякину, талую воду и другие объекты, загрязненные выделениями грызунов, воду из естественных водоемов и гидробионтов и др. Среди членистоногих переносчиков в лабораторию посылаются иксодовые клещи, эктопаразиты, собранные с мелких млекопитающих (вши, гамазовые и краснотелковые клещи, блохи). При трансмиссивных вспышках посылают кровососущих двукрылых (комаров, слепней и др.). Каждую найденную пробу во избежание контаминации заворачивают в отдельный лист бумаги. Собранный с одного места материал помещают в отдельные матерчатые мешки и этикетируют. Для длительного хранения материал тщательно просушивают.

Рис. 7 Схема лабораторной диагностики туляремии

Лабораторная диагностика. Обнаруженные при обследовании природных очагов туляремии мумифицированные трупы, высохшие шкурки и кости зверьков исследуют методом ПЦР и иммунными реакциями (ИФА), позволяющими обнаружить ДНК возбудителя или туляремийный антиген. Мелких млекопитающих, добытых в природе орудиями лова или живыми, исследуют биологической пробой. Животных, добытых живыми, исследуют на наличие туляремийных антител, для чего используют сыворотку крови или «смывы» из грудной полости.

При исследовании домашних животных (крупный рогатый скот, свиньи, овцы и др.) используют главным образом серологические методы, реже – внутрикожную пробу с тулярином. Посевы из органов или биологические пробы применяют только при обследовании павших, забитых или больных животных. Исследуют в первую очередь лимфатические узлы и селезенку.