Бактериоскопия. Ввиду очень мелких размеров туляремийный микроб
может быть достоверно обнаружен в окрашенных мазках-отпечатках только из обильно обсемененного патологического материала. Четко положительные результаты получают при содержании в 1 г ткани более 1 млрд. микробов. Поэтому бактериоскопия эффективна при исследовании павших диких или зараженных лабораторных животных, но обычно безуспешна при исследовании убитых на ранних стадиях заболевания зверьков. Метод не используется также при исследовании воды, смывов с объектов внешней среды, где концентрация возбудителя может быть незначительной.
Возбудитель туляремии Francisella tularensis грамм-отрицательная палочка, часто кокковидная, 0,3–0,7 мкм, иногда до 0,15 мкм и меньше. При окраске по Романовскому-Гимза бактерии туляремии имеют сиреневый цвет и легко определяются по размерам, форме и тенденции к скученному расположению.
Люминесцентная микроскопия. Люминесцентная микроскопия является эффективным методом обнаружения возбудителя туляремии, позволяющим выявлять как живые, так и мертвые туляремийные бактерии. РИФ позволяет обнаружить туляремийные бактерии при отрицательном результате световой бактериоскопии.
Рис. 8 Возбудитель туляремии. Окраска по Граму, скученное расположение клеток
Культуральный метод. Посев на питательные среды применяют для выделения культуры возбудителя туляремии из органов павших или забитых диких животных, павших или убитых лабораторных животных, а также зверьков, у которых обнаружены патолого-анатомические изменения, характерные для туляремии. Иксодовых клещей, воду, почву, смывы с объектов внешней среды не исследуют посевом ввиду их загрязнения посторонней микрофлорой.
Возбудитель туляремии не растет на обычных питательных средах (МПА и МПБ), что служит одним из признаков при идентификации культуры. Наиболее практичной и обычно применяемой средой для выделения и культивирования туляремийного микроба является свернутая желточная среда (Мак-Коя), среда Френсиса, желточная среда Дрожевкиной, кровяной рыбно-дрожжевой агар с глюкозой и цистином.
При обильном засеве рост туляремийных бактерий на свернутой желточной среде появляется в виде сплошного роста уже через 18–24 ч инкубирования при 37°С; при засеве малым количеством бактерий отдельные колонии становятся заметными на 3–5 сутки и позднее. Посевы следует выдерживать в термостате до 10–12 суток. По внешнему виду рост туляремийных бактерий на свернутой желточной среде хорошо отличается от большинства других бактерий, имеет вид извилистого, слегка блестящего (не сухого), почти бесцветного нежного налета. На среде Френсиса культура имеет вид небольших (1–2 мм), круглых, выпуклых, гладких, блестящих, с ровными краями колоний беловатого цвета с голубоватым оттенком. В жидких питательных средах возбудитель растет гораздо хуже. Хорошо размножаются в желточном мешке куриного эмбриона.
Рис. 9 Колонии Francisella tularensis на среде Френсиса
Рис. 10 Колонии Francisella tularensis на желточном агаре
Серотипирование. Антигенную специфичность выделенной культуры проверяют с помощью реакции агглютинации с агглютинирующей сывороткой.
Биологический метод. Для биологической пробы обычно используют белых мышей (или морских свинок), которые заболевают и гибнут от туляремии при подкожном введении суспензии, содержащей единичные бактерии. При массивном инфицировании исследуемых объектов мыши погибают уже на 3–4 сутки; при меньшей обсемененности материала гибель животных может затянуться до 7–9 суток, иногда до 15–20 суток. В большинстве случаев животные погибают от туляремии с характерными патолого-анатомическими изменениями: обнаруживаются воспалительные изменения ткани на месте заражения (плотный инфильтрат), увеличение, уплотнение и гиперемия лимфатических узлов, особенно близлежащих к месту заражения, резкая гиперемия сосудов подкожной клетчатки, уплотнение и увеличение селезенки, печени, увеличение и гиперемия надпочечников, гиперемия тонкого кишечника.
Серологическая диагностика. Наиболее эффективными и доступными методами выявления антител являются реакция агглютинации (РА) и реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Титры антител у переболевших диких животных колеблются в пределах 1:103–1:320, редко выше, в зависимости от давности заболевания. У сельскохозяйственных животных они могут достигать 1:3203–1:640, но чаще бывают низкими. Диагностическими титрами следует считать в РА – 1:40 и выше и в РНГА – 1:160 и выше. Положительные реакции в РНГА следует контролировать в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Наличие антител у животных указывает на контакт животного с возбудителем туляремии и наличие эпизоотии. Обнаружение специфических антител у домашних животных имеет ориентировочное значение и служит сигналом для проведения на данной территории детальных эпизоотологических исследований на туляремию.
Идентификацию возбудителя туляремии осуществляют на основании совокупности следующих признаков:
- морфологии и окраски бактерий в мазках и специфического свечения в РИФ;
- характера роста на свернутой желточной среде;
- отсутствия роста на простых питательных средах;
- агглютинации специфической туляремийной сывороткой;
- определения ДНК возбудителя туляремии в различных объектах;
- патогенности для белых мышей и морских свинок.