Оборот белка в митохондриях

Как описано выше, белки, предназначенные для второго ичных пластид трафика сначала к системе секреторной, а затем ввести пластиды. В отличие от этого, вступление в первичных эндосимбионтов - как митохондрий и пластид - как правило, не включает в себя секреторную систему. Скорее всего, белки переводятся на свободных цитозольных рибосомах, или на рибосомах шиповальных наружную мембрану органелл, и введите органеллы непосредственно в силе транслокации машин. Это в значительной степени изученная тема apicomplexans, но некоторые моменты были inves-tigated, в основном совместно с пластидами ориентации исследований (смотрите раздел 9.2.7). Как это ни парадоксально, один из первых последовательностей, показанных функционировать как mitochon-drial направл ющую последовательность в T.gondii, было получено из аккуратного белка S9. На своем N-конце, T. Ген кодирует гондия S9, сигнальную последовательность и предсказанные пластиды направли ющую последовательность, которые вместе способны целевой GFP в apicoplast. Однако, когда только последовательность транзитных присутствовал, GFP, был нацелен на митохондрии (DeRocher и др., 2000). транзитные пептиды пластиды, действительно напоминают митохондриальные ориентации последовательности. Оба вида topogenic сигналов показывает значительное Flex-ibility в последовательности и богаты основных аминокислот, но митохондриальные ориентациях последовательность в основном принимает амфипатическую структуру, которая

не является существенным для транзитных пластид пептидов (рассмотренных в Haucke и Schatz, 1997). Доставка белков в правильное расположение облегчается путем отвлечения Т. Gondii apicoplast белков в систему секреторной. Следовательно криптические последовательности митохондриальных ориентации не выявлены до тех пор, пока сигнальная последовательность отщепляется, в какой момент митохондриальной нацеливание больше не может произойти.

Бриджеса сообщили аналогичный неожиданный результат при оценке внутриклеточных местоположений Т. гондий железы супероксиддисмутазов (FeSOD2) (Бриджес и Carruthers, 2003). Этот ген имеет предсказанный apicoplast направл ющую последовательность, состоящую из сигнальной последовательности N-концевой последующей транзитной последовательностью. Неожиданно, когда направл ющий последовательность сливают с GFP и трансфицировала в Т. гондия, это была митохондрия, а не apicoplast, который флуоресцирующий. Изменение одной аминокислоты в сигнальной последовательности из аргинина на аланин было достаточно, чтобы отвлечь GFP в apicoplast (Бриджес и Каррутерс, 2003). Совсем недавно, Солдати и его коллеги исследовали дополнительно нацеливание Т. гондий FeSOD2, на этот раз, глядя на полный белок, слитый с С-концевым эпитопом тега вместо просто направл юща последовательность слитого с GFP. Эта конструкция локализуется как apicoplast и митохондрии. Добавление в ЭР-удерживающий мотив, HDEL, к эпитоп-меченый FeSOD2 допускается к обороту митохондрии, но ограничено ориентации на apicoplast удержания в ЭР (Д. Soldati, личное сообщение). Эти эксперименты показывают, что контекст последовательности N-концевой нацеливающей также влияет на локализацию, и указывают на необходимость осторожности в приписывании клеточных локализаций на основе предсказанных последовательностей торговли людьми и экспериментов с мечеными белками. Они также показывают, что двойное нацеливание nuclearly кодируемых белков является фактором в функции органелл Т. гондий. к эпитопу-меченый FeSOD2 допускается к обороту митохондрии, но ограничен при ориентации на apicoplast удержание в ЭР (Д. Soldati, личное сообщение). Эти эксперименты показывают, что контекст последовательности N-концевой нацеливающей также влияет на локализацию, и указывают на необходимость осторожности в приписывании клеточных локализаций на основе предсказанных последовательностей торговли людьми и экспериментов с мечеными белками. Они также показывают, что двойное нацеливание nuclearly кодируемых белков является фактором в функции органелл Т. гондий. к эпитопу-меченый FeSOD2 допускается к обороту митохондрии, но ограничен при ориентации на apicoplast удержание в ЭР (Д. Soldati, личное сообщение). Эти эксперименты показывают, что контекст последовательности N-концевой нацеливающей также влияет на локализацию, и указывают на необходимость осторожности в приписывании клеточных локализаций на основе предсказанных последовательностей торговли людьми и экспериментов с мечеными белками. Они также показывают, что двойное нацеливание nuclearly кодируемых белков является фактором в функции органелл Т. гондий. и указывают на необходимость осторожности в приписывании клеточных локализаций на основе предсказанных последовательностей торговли людьми и экспериментов с меченых белков. Они также показывают, что двойное нацеливание nuclearly кодируемых белков является фактором в функции органелл Т. гондий. и указывают на необходимость осторожности в приписывании клеточных локализаций на основе предсказанных последовательностей торговли людьми и экспериментов с меченых белков. Они также показывают, что двойное нацеливание nuclearly кодируемых белков является фактором в функции органелл Т. гондий.

Двойная нацеливание позволяет гену делать двойную работу, кодирование продуктов, которые функционируют в более чем одной внутриклеточной локализации. Примеры двойственных-мишенью белков становятся все более распространенным, особенно в Arabidopsis (Дюшен и др., 2005). Чаще всего, белки участвуют - тРНК синтетазы, РНК поли-merases, а также различные ферменты, чтобы назвать несколько - необходимо как для митохондриальных и пластид

функции (рассматриваемые в Петерс и малых, 2001; Silva-Filho, 2003; Karniely и Pines, 2005). Тем не менее, есть и примеры двойного таргетинг митохондрий и пероксис, митохондрии и ER, и хлоропласты и ER (Кисслинг и др, 2004 (Петрова и др., 2004) (Левитан и др., 2005). Левитан и др., 2005), а также тройные мишени-тов митохондрий, ядро ​​и цитозоль (Мартин и Хоппер, 1994). Во многих случаях, альтернативный сплайсинг или использование альтернативных кодонов инициации производит достаточные различия, чтобы направить несколько различных генные продукты к различным частям клетки. В других случаях, после transla-ционной модификации влияют на локализацию (Silva-Filho, 2003). До сих пор, FeSOD2 является единственным белком Т. гондий продемонстрировал быть направлены к нескольким органелл. Тем не мение, нет достаточного количества тРНК-синтетазы и рибосомные белки, кодируемые геном P. фальципарум для каждого из трех отсеков перевода - цитозоле, apicoplast и митохондрии - иметь эксклюзивный набор генов необходимых компонентов (Gardner и др., 2002). Первоначальные анализы гондий генома T. указывают низкие числа для некоторых из соответствующих генов (Д. Soldati, персональный commu-nication), и вполне вероятно, что двойное нацеливание будет фактором для многих apicomplexans.

Сравнительно небольшой прогресс был достигнут в отношении идентификации компонентов системы митохондриального импорта Т. Gondii. Генома Т. гондий кодирует ортологи, по меньшей мере, четырех предполагаемых внутренней мембраны митохондрий translocases, Tim17, Tim22, Tim23, Tim44, и, возможно, Tim9. Тем не менее, ни один из наружной мембраны translocases-Ding корреспондентских не были идентифицированы в T.gondii, или других apicomplexans. Только cpn60 (HSP60), классический митохондриальной Chaper один вовлечен в импорт, был охарактеризован (Toursel и др., 2000). МРНК HSP60 является альтерна-тивно сращено и оба из мРНКа более многочисленны в bradyzoites, чем в тахизоитах, как это белок HSP60. Анализ иммунофлуоресценции с анти-Т. гондий HSP60 антитело подтверждает mitochon-drial локализации в тахизоитах, но любопытно, что в начале брадизоитного для тахизоят преобразования, одни и те же антитела обнаружить две неизвестные тела в пределах или ниже ядра. Это преходящая локализация

потерял 18 часов, а его значение неизвестно (Toursel и др., 2000).

Энергетический обмен

Митохондрии обычно описывается в вводных классах биологии, как электростанция клетки. Это сайт цикла трикарбоновых кислот и цепи переноса электронов, которые действуют совместно, чтобы эффективно преобразовывать продукты катаболизма глюкозы в АТФ. Другие функции органелл часто получают мало упоминания. Тем не менее, в то время как митохондриального дыхания является ключевым для aerobi-чески дышащих клеток, многие паразитарные клетки находятся в средах с низким напряжением кислорода и полагаться, по меньшей мере частично на альтернативных средств для производства энергии. Это может привести к модификации энергогенерирующих путей потери или некоторым ферментов или стадия-нию заменить. Оценка содержания фермента в гондий митохондрии T. В настоящее время ожидает на шаге аннотации генома Т. гондий, и значительные дополнительные усилия будут необходимы для проверки предсказаний и в полной мере оценить митохондриальные роли. Некоторые комментарии уже могут быть сделаны, однако. Важно отметить, что гондии митохондрия Т. может быть окрашена с родамином 123, флуоресцентным красителем, который accumu-ЛАТЕС в органеллах, которые имеют высокий трансмембранный потенциал (Tanabe, 1985). Диафораза окрашивание еще один классический способ маркировки активной мито-chondria. Активный митохондриальной диафораза использует NADH или NADPH в качестве субстрата для уменьшения тетразола, производя плотный, черный осадок. В присутствии НАДФН, Т. гондий тахизоиты пятно темно в то время как митохондрии в клетке-хозяине, не делают. Обратное справедливо для NADH (Seeber и др., 1998). Эти данные указывают на генерации электрохимического градиента, но роль гондий митохондрии Т. в генерации энергии является спорным.

Относительное значение гликолиза и митохондрий-chondrial дыхания у Т. Gondii энергии родов Тион все еще расследуется. Тахизоиты имеют кристатные митохондрии, как правило, связанные с митохондриальным дыханием, но они сильно зависят от гликолиза для производства энергии. Bradyzoites делать, как хорошо, но есть различия в активности ферментов

234 APICOPLAST И митохондрия токсоплазма

между этими этапами. Активность фермента гликолиза фосфофруктокиназы является в два-три раз в bradyzoites ниже, чем в тахизоитах (Дентон и др., 1996). Два других гликолитические ферментов, глюкоза-6-фосфат-изомераза и енолаз, которые активируются в bradyzoites (Dzierszinski и др., 1999). С другой стороны, изоцитрат dehydroge-Nase активности, а затем в качестве индикатора цикла Кребса, был низким и неизменным между стадиями (Дентон и др., 1996). Вместе эти данные свидетельствуют о том, что гликолиз является необходимым для производства энергии в обеих тахизоитах и ​​bradyzoites, хотя, возможно, не до такой же степени.

Большая часть пирувата, полученного путем гликолиза превращается в лактата лактатдегидрогеназы. Т. гондий имеет два лактат дегидрогеназа генов, один, выраженные в обеих тахизоитах и ​​bradyzoites, а РНК из других брадизоитных специфического (Янг и Parmley, 1995, 1997). Bradyzoites есть примерно в три раза лактатдегидрогеназы Activ-нимости тахизоитов (Дентон и др., 1996), но не известно, является ли это увеличение непосредственно связано с экспрессией второго изофермента. Дентон и соавт. (1996) предположили, что bradyzoites нужна лактатдегидрогеназа для катаболизма амилопектина, полисахарид хранения, который в изобилии в осумкованных паразитах.

Пируват также обычно направляются к chondrion-митохондрий, где пируват-дегидрогеназы (PDH) начинает свое превращение в ацетил-КоА, точку входа в цикле Кребса. Однако, как Т. гондий и П. фальципарум имеют только один PDH, который проживает в пластиды, а не mitochon-drion (Фот и др, 2005;. Ralph, 2005). Другие данные указывают на роль аэробного дыхания, особенно во внеклеточных тахизоитами (см ниже); при отсутствии митохондриального PDH, что является источником для митохондриальной ацетил-КоА? Ответ остается неясным, но преобразование пирувата в ацетил-КоА в достигается за счет трех ферментов цикла: PDH, dihydrolipoamide дегидрогеназы (LipDH) и dihydrolipoamide S-ацетилтрансферазы. Есть два гена для каждого из последних двух ферментов в П. малярийного, с N-концевые последовательности предсказали трафик одного из каждого гена в apicoplast или митохондрии (McMillan и др., 2005). Прогнозируемая локализация была подтверждена для

LipDHs с использованием GFP слитых к таргетингу последовательностям (McMillan и др., 2005).

Несколько линий доказательств точки к обеспечению митохондриальной цепи переноса электронов в Т. гондиях. Проникающего вещества красители клеток родамина 123 и Mitotracker (Invitrogen), служат в качестве показателей дыхания митохондрий, так как они флуоресцируют только при наличии высокого трансмембранного потенциала. Внеклеточные тахизоиты и хост мито-chondria этикетка с ярко родамином 123, в то время как внутриклеточные тахизоиты не помечены (Tanabe, 1985;. Мело и др, 2000). Эти результаты были между preted как указывающий, что внутриклеточная Т. гондий имел

a неработающие митохондрии. Тем не менее, Mitotracker этикетки внутриклеточные, а также extracel-lular тахизоиты (Мело и др., 2000). Кроме того, цито-химическое окрашивание на цитохром с оксидазы активности этикетки крист митохондрий в обеих стадиях (Seeber и др., 1998;. Мело и др, 2000). Митохондриальная Activ-ность может уменьшить следующий переход от внеклеточного к внутриклеточному образу жизни, но эти данные убедительно свидетельствуют о том, что митохондриальная respira-ция продолжается после вторжения в клетки-хозяина.

Т. гондий митохондриальная биохимия оценивали с помощью внеклеточных тахизоитов perme-abilized дигитонина. Потребление кислорода измеряли в присутствии различных мито-chondrial субстратов и ингибиторов. Ротенон ингибирует сложный I митохондриальной цепи переноса электронов (NADH-убихинон oxidoreduc-TASE), уменьшая тем самым поток электронов и в конечном счете, уменьшая потребление кислорода при комплексной IV. Воздействие T.gondii, чтобы Ротенон произвел небольшие изменения в потреблении кислорода (Vercesi и др., 1998), хотя препарата, как и другие ингибиторы митохондриальных, стимулирует переход к bradyzoites (Tomavo и Бутройда, 1995). Несколько possibili-связи могут объяснить это кажущееся противоречие, в том числе деятельности ротенона при высоком концентре-страции против других митохондриальных ферментов. Кроме того, проницаемость Т. гондий мито-chondrion к ротенону неизвестно. Существуют противоречивые данные о чувствительности ротеноном для других apicomplexans (Гинзбург и др, 1986;.. Гозар и др, 1992;. Uyemura и др, 2000, 2004;. Krungkrai и др, 2002). Хотя этот вопрос остается нерешенным, PlasmoDB (Киссинджер и др.,

2002) перечисляет П. трехдневный NADH-оксидоредуктазу с митохондриальным сигналом таргетинга и показывает сильное сходство с ротеноном нечувствительного ортолога в Solanum tuberosum. Ген Т. гондий с сильным подобия (значение E 10^-83) Могут быть идентифицированы с помощью BLAST запроса на ToxoDB.org.

Чувствительность потребления кислорода с другими ингибиторами предполагает, что типичный убихинол-цитохром с оксидоредуктазой (комплекс III) и цитохром С-оксидаза (комплекс IV), присутствует и способствует генерациям градиента electrochemi-кала (Vercesi и др., 1998). Олигомицин, который специфически нацелен на митохондриальный F₀F₁АТФ-синтазы, тормозит потребление кислорода в extracel-lular тахизоитов. Он также замедляет рост Т. гондий в клетках-хозяевах, которые испытывают недостаток в митохондриальный геном и, таким образом, не в состоянии сделать функциональный F₀F₁АТФ-синтазы. Эти данные свидетельствуют о том, что является олигомицином ингибирования Т. гондий митохондриального АТФ-синтазы (Bohne и др., 1994).

Альтернативные оксидазы были описаны в растение, грибковых и протозойных митохондрий, в хлор-Plasts, а в некоторых бактерий. Этот челночные гидрогенераторы к кислороду Gens без прохождения через комплексы III и IV. Цианид цель комплекса IV, так что обнаружение цианида-нечувствительное дыхание у P. малярийного предложила активность альтернативной оксидазы (Мерфи и др., 1997). Кроме того, салициловая-гидроксамовая кислота, которая ингибирует альтернативные оксидазы, уменьшает рост P. малярийного и

T. гондий (Мерфи и Ланг-Unnasch, 1999). Несмотря на эти замечания, не убедительна канди-дата гена оксидазы альтернативному не была идентифицирована-Fied в геномах П. Т. или тропической Gondii. В противоположность этому, геном культуры C.parvum включает в себя ген с сильным сходство с альтернативными оксидаз и митохондриального направл юща последовательность (Roberts и др., 2004). Решение вопроса альтернативного использования оксидазы в Т. гондии ожидает дальнейшее исследование.

Хотя многие детали остаются нерешенными, то ясно, что и гликолиз и митохондриальный Respi-Рацион используются Т. гондиями, возможно, с изменением между этапами. Многие ресурсы, поступающие нести от секвенирования проектов и связанных с ними усилия должны иметь благотворное влияние на эти вопросы.

Другое обмен

Важность окислительного фосфорилирования настолько велика, во многих клетках, что другие функции митохондрии иногда были пропущены (рис 9,10). Среди этих функций являются Форме-ции Fe-S комплексов, биосинтеза гема, окислительно-восстановительных реакций, и многое другое. Гены для некоторых из этих Адди-ционных функций митохондрий были описаны из T. гондий. На момент подготовки этой главы, аннотации 10×Т. гондий дробовик последовательность генома была завершена, так Адди-нальных идеи в митохондриальную функцию, как ожидается, в ближайшее время. Данные из трехдневной генома P. также предложить возможные функции для Gondii митохондрии Т., указанных ниже.

Митохондрии, как хлоропласты, полагаться на Fe-S кластеров для ключевых функций. Apicomplexans по всей видимости, использовать два различных биосинтетических путей для получения кластеров Fe-S. Один напоминает нефотосинтетические растения и apicoplast локализованный (смотрите раздел 9.2.9). Другой похож на путь-дорогу, найденного в митохондриях, и некоторые из его генов предсказали митохондриальные ориентации последовательностей (Seeber, 2002).

Биосинтез Гема обычно представляет собой митохондриальная активность в клетках, не имеющие хлоропласты и хлор-Пласт активность в тех, которые имеют их. В APICOM-plexans, как описано в разделе 9.2.9, процесс, как представляется, распределяется между органеллами. На основе исследований локализации с GFP слитых белков, гем путь биосинтеза начинается в митохондрии, переходит к apicoplast, и возвращается в митохондрии. Это требует прохождения реагентов между органеллами дважды. Оба ЭМ и флуоресцентная микроскопия показывают зону близости между двумя органеллами (Хопкинс и др., 1999). Вполне возможно, что эта тесная связь помогает движению реагентов.

Митохондрии также известны принять участие в биосинтезе пиримидинов. В этом пути, уменьшение дигидрооротата к оротат катализируются дигидрооротатдегидрогеназа (DHOD), который проходит электроны убихинона в комплексе II митохондриальных Т.Д. Как и следовало ожидать, учитывая эти отношения, П. фальципарум DHOD локализуется в митохондриях (Krungkrai, 1995). Т. гондий DHOD

236 APICOPLAST И митохондрия токсоплазма

Активность также может быть локализованы митохондрии, так как он находится с твердыми частицами следующего subcel-lular фракционирования, тогда как другие пиримидиновые Биосине-тезис ферменты в растворимой фракции (Асаи и др., 1983). В то время как житель в эритроцитах, П. фальципарум заполняет свои потребности в энергии от гликолиза, с умопомрачительной лактата (обзор Sherman, 1979). биосинтеза пиримидинов была выдвинута гипотеза, чтобы объяснить, почему функциональный митохондриальная цепь переноса электронов по-прежнему требуется в этих клетках (Гаттеридж и др., 1979). Это может быть одной из Func-ций в гондий митохондрии Т. а.