Bradyzoite- и тахизоят специфические промоторная области были использованы для создания реагентов для изучения дифференцировки в пробирке (Gross, 1996). Гены-репортеры, такие как хлорамфеникол ацетил-tranferase (CAT),βгалактозидазы, люцифераза и является полезной для отображения активности промотора и определения минимальных промоторных последовательностей. Исследования с использованием этих маркеров подтвердили экспрессию сценической-специфичного SAG1 как тахи- zoite маркеров, и LDH2 и BAG1 в качестве маркеров брадизоитных. Стадия-специфические факторы транскрипции или другие регуляторные молекулы до сих пор не идентифицированы-Fied (Bohne и соавт, 1997;. Янг и Parmley, 1997;. Мы и др., 2004; Итон и др, 2005). Стадиеспецифический репортер конструкции были использованы как в Тран-sient и стабильной трансфекции анализов. Другой ген-репортер, который оказался полезным для идентифицируемых-фикации брадизоитный мутантов дифференцировки по FACS зеленый флуоресцентный белок (GFP), (Matrajt и др., 2002; Singh и др., 2002).
Можно было бы ожидать, что нокаут гена брадизоитного конкретный бы целесообразен, так как рост должен происходить на стадии тахизоит даже если предотвратить развитие брадизоитного. Эта стратегия была применена к брадизоитному конкретному гену BAG1 / hsp30 (BAG5) (Bohne и др., 1998; Zhang и др., 1999). BAG1 Нокаут был создан с использованием HGXPRT в качестве селективных маркеров в качестве HGXPRTнегPLK штамм T. гондий (Bohne и др., 1998). Другой BAG1 нокаут проводили с использованием CAT в качестве селективных маркеров в клоне штамма PLK, который был пассированным через мышей, чтобы убедиться, что он сделал кисты в начале исследования (Zhang и др., 1999). Образование цист в пробирке и в естественных условиях происходит в обоих нокаутов, указывая, что BAG1 не является существенным для образования цист. Жанг и др. (1999), однако, обнаружили, что число цист, образующихся в естественных условиях в CD1 мышей была снижена в BAG1 нокаутов. Комплементация привела к созданию подобных номеров
| ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО БИОЛОГИИ брадизоитный |
кисты в естественных условиях, как и в PLK штамма дикого типа (Zhang и др., 1999). Когда паразиты выращивали в нитропруссид натрия (SNP), то BAG1 нокаута росли быстрее, чем PLK. Это может быть результатом разницы в скорости перехода от быстро растущей тахи- zoite к медленно растущей стадии брадизоитной в этом BAG1 нокауте. Уменьшение образования кист является относительно тонкого фенотипа, чего не наблюдалось, когда BAG1 была нарушена в HGXPRTнег PLK деформации фона (не пассируют у мышей до нокаута) и образованию кист был протестирован в сильно восприимчивого мышей C57BL / 6 (Bohne и др., 1998).
Способность преобразовывать тахизоят к брадизоитному является ключевым элементом для Т. Gondii настойчивости в хозяине, и, таким образом, вполне вероятно, что несколько генов с избыточными функциями участвуют в этом процессе. Малые белки теплового шока, такие как BAG1, постулировались выступать в качестве специализированных Chaper-онов для таких ферментов, как глутатион-редуктазы в процессе дифференцировки, но точная функция таких малых белков теплового шока неизвестна. Вполне возможно, что другие малые белки теплового шока в T.gondii, может частично компенсировать отсутствие BAG1 (де Мигель, 2005).
Организатор захват является эффективным технически Nique для идентификации генов, индуцируемых в ходе брадизоитных дифференцировок. Промотора гипоксантин-ксантин-гуанин фосфорибозилтрансфераза-tranferase (HGXPRT) гена с 6-thoxanthine (6-TX) или 8-азагуанином (8-AzaH) в качестве отрицательного Selec-ции и микофенольная кислота с ксантин (MPA-X) в качестве позитивного выбор был использован несколько групп (Bohne и соавт, 1997;. Холмик и Boothroyd, 1998a, 1998b). Выбор работ путем выращивания транса-Инфицированных паразитов при рНе 7,0 в присутствии 6-TX, который убивает все организмы, которые имеют ген HGXPRT на конститутивный промоторе или тахизоят. Для подтверждения брадизоитных специфичностей этой популяции организмов затем подвергаются рНу 8,0 и MPA-X, и только паразитам, которые выражают HGXPRT (т.е. те, с брадизоитным или конститутивным промотором в передней части гена HGXPRT) будут выжить. Следует отметить, что этот подход может быть «вытекающей», в зависимости от концентрации 6-TX и MPA-X используется. Тем не менее, когда 6-TX и МР-X выборы повторяются несколько раз,
один будет обогатить популяцию для организмов с HGXPRT под контролем брадизоитных специфических промоторов генов. Используя этот подход, дополнительные брадизоитные специфичных промоторы (Дональд и Русо, неопубликованный;. Цитируются в Matrajt и др, 2002) и восемь брадизоитных конкретной рекомбинантный (РБЙ) штаммы были получены (Knoll и Бутройд, 1998b). Один из них, BSR4, позднее было установлено, что брадизоитный поверхностный антиген p36, который был предварительно идентифицирован с помощью моноклонального антитела (Knoll и Бутройда, 1998b).
Два дополнительная генетическая стратегия была Devel-Oped для идентификации мутантов, неспособных пройти Brady-zoite дифференцировки (Matrajt и др., 2002; Singh и др., 2002). Синг и др. (2002), генерируемые мутанты точки в LDH2-GFP Prugnaiud (типа II) фоне, который выражает GFP под контролем брадизоитного-специфический промотор LDH2, чтобы получить мутанты с измененной способностью превращаться в bradyzoites (Singh и др., 2002). Паразиты не в состоянии дифференцировать были определены FACS обогащением GFP-отрицательных паразитов, когда эти организмы были подвержены брадизоитным индуцирующими условиями.
Matrajt и др. (2002) также использовали инсерционный мутагенез сконструированной стабильной линии, экспрессирующих
a брадизоитный конкретных pT7-HGXPRT кассета в УПРТ-дефицитных RH (тип I) паразитов (Matrajt и др., 2002). Предыдущие исследования показали, что RH
УПРТ disruptants дифференцироваться в bradyzoites в условиях CO2голодание (Bohne и Руса, 1997). РТ7-HGXPRT стабильная линия была получена раундами отрицательного и положительного отбора, чередуя 6-TX (условия тахизоят) с MPA-X (условия брадизоитных) выбором. Результате клеточная линия, где был высоко HGXPRT регулируется условиями дифференциации. Инсерционный мутаген-ESIS Затем проводили в этой линии рТ7-HGXPRT использование DHFR кассеты, что ранее были показано, имеет высокую частоту негомологичной INSER-ции (Donald и Roos, 1993). Неспособность отличаться-entiate в bradyzoites была обнаружена неспособность disruptant выразить HGXPRT.
Обе группы были в состоянии продемонстрировать, что эти мутанты дифференцировки не смогли сделать bradyzoites в той же степени эффективности в качестве родительских штаммов, и обе группы демон-strated глобальные дефекты в выражении ранее
360 РАЗВИТИЕ брадизоитного
характеризуется маркеры, как определено иммуно-флюоресценции и анализа микрочипов. Из-за технические трудности, ическим, точные мутации не могут быть идентифицированы. В инсерционные мутанты были определены Matrajt и соавт. (2002) были похожи на BAG1 нокаут, описанный Zhang и др. (1999), и имел более быстрый рост при брадизоитных индуцирующих условиях, чем видна на паразитах дикого типа (Matrajt и др., 2002). Микрочип анализ этих мутантов идентифицируемых-классы специалисты-генов, в том числе 14-3-3 гомолога, киназы PISTLRE и вероятные вакуолярные АТФаз, экспрессия которого был снижено у мутантов дифференциального-ции (Matrajt и др., 2002; Singh и др., 2002). Микрочипов исследование этих мутантов предположил, что существует hierocracy экспрессии генов в процессе дифференцировки брадизоитный (Синг и др., 2002),
Ванчайнатан и др. (2005), с помощью инсерционного мутагенеза FACS стратегии, аналогичного Синг и др. (2002) и др Matrajt. (2002), которые были определены два дифференциации мутантов - TBD-5 и ТБД-6 - то переключиться на bradyzoites в 10 и 50 процентов от уровней дикого типа соответственно (Ванчайнатан и др., 2005). TBD-5 имели множественные инсерции и не CHARAC-зуется дальше, но TDG-6 имел одну вставку 164 п.о. вверх по течению от сайта инициации транскрипции гена, кодирующего белок, цинковый палец (ZFP1). ZFP1 ориентирован на ядрышко паразита ККА мотивов и значительно измененные уровни экспрессии по-видимому, являются токсичным для Т. гондий. Фенотип развития пониженной брадизоитный может быть воспроизведен с помощью направленной интеграции в одной и той же области выше по течению.
Нолл и его коллеги сделали библиотеку Signa-р-мечеными мутантов (Knoll и соавт., 2001; Mordue и Knoll, не опубликовано), которые были проверены в естественных условиях и в пробирке. Некоторые из этих мутантов имеют дефекты в формировании кисты, в то время как другие имеют дефекты внутриклеточного роста. (Knoll и др., Неопубликованные данные). Характеристика и спасение этих мутантных генов текущий проект (Knoll и др., Неопубликованные данные).
РЕЗЮМЕ
Исследования брадизоитный биологии и дифференциации тахизоитами в bradyzoites
были ускорены путем разработки методов в пробирке для изучения и производят Brady-zoites, а также с помощью генетических инструментов, которые существуют для манипулирования Т. гондий. Недавние Комплексы-ции генома Toxoplasma и развития и интеграции выражения базы данных SAGE с базой данных генома обеспечивает дополни-тельные важные инструменты для изучения развития брадизоитного.
К сожалению, генетические триггеры и датчики для ответа дифференцировки еще предстоит определить. Многие из особенностей этого отличительного Тион напоминает эпигенетические явления, описанных в других системах. Брадизоитный отличительный-ции, как представляется, в сочетании с замедлением клеточного цикла. Вполне вероятно, что многие сигналы могут привести к соответствующим сигналам, которые индуцируют образование Brady-zoite. Развитие bradyzoites, как представляется, стресс-опосредованной дифференциация ответа, что приводит к метаболическим приспособлениям. Совершенно очевидно, что транскрипция целого набора генов брадизоитного конкретных происходит во время отличаются-entiation. Эти генные продукты включают метаболические ферменты, поверхностные антигены, секреторные антигены (в том числе rhoptry белков), а также компоненты, киста стенок.
Исследования механизма (ов), с помощью которого разработки-ния инициируется и скоординированы должен eventu-союзника результат в идентификации новых терапевтических стратегий для контроля токсоплазмоза. Эти достижения в конечном итоге могут привести к радикальному лечению инфекции, устраняя скрытую Т. гондий стадии кисты в ткани. Кроме того, генетические Strate-логии, которые предотвращают образование кисты могут также оказаться полезными при разработке вакцинных штаммов данного патогенного apicomplexan.
БЛАГОДАРНОСТЬ
Эта работа была поддержана грантами AI39454 NIH (НМ) и AI060496 (КК), и контракта NIH для Альберта Эйнштейна Biodefense протеомики Центра. Мы благодарим члены нашей лаборатории за их преданность, и наших коллег в сообществе Toxoplasma для стимулирования дискуссий и обмен неопубликованных данных.