Соматическая генная терапия.

Векторы, используемые для трансформации

Клеток человека

Имеется множество генов, дефект которых приводит к серьезным заболеваниям, часто с летальным исходом. Разработанные методы соматической генной терапии прежде всего применяются для замены дефектных или восполнения отсутствующих генов в организме чело­века. При этом должны соблюдаться следующие условия:

1) для излечения необходимо выбирать те болезни, которые вы­
званы серьезными генетическими нарушениями, приводящими к ле­
тальному исходу;

2) болезнь должна быть корректируема путем введения транс­
формированных клеток костного мозга, поскольку это единственная
ткань, которую можно легко выделить, обработать и вернуть пациен­
ту;

3) дефект должен находиться в гене, кодирующем фермент с про­
стой регуляцией;

4) нужно получить нормальный ген с набором всех необходимых
элементов регуляторов.

Наиболее изученным и впервые использованным в генной тера­пии является ген, кодирующий аденозиндезаминазу (АДА), отсутствие которой приводит к серьезным иммунодефицитным заболеваниям человека. У таких пациентов извлекали клетки костного мозга, в ко­торые встраивали нормальный ген при помощи ретровиральиых век­торов. Далее трансформированные клетки возвращали в организм больного, обеспечивая им преимущественные условия для роста, в ре­зультате чего удалось наладить производство необходимого фермен­та в организме и снять иммунодефицитное состояние. Другое заболе­вание, которое было излечено методом генетической терапии, — это фенилкетонурия, и здесь для трансформации также были использо­ваны клетки костного мозга.

Вслед за разработкой методов лечения генетических дефектов возникла проблема создания эффективных векторных систем. В на­стоящее время наиболее применимыми являются векторы на основе ретровирусов, которые позволяют трансформировать самые разнооб­разные клетки человеческого организма, при этом их ДНК, несущее терапевтический ген, встраивается в ДНК клеток в виде единствен­ной копии и обычно не вызывает перерождение клеток. Такие ретро-виральные векторные системы были сконструированы на основе ви­руса лейкоза мышей Молони. Разработанные векторы могут быть использованы для трансформации клеток не только взрослого, но и детского организма. В настоящее время исследования с этими векто­рами, несущими ген АДА, проводятся на приматах, и было показано, что они способны правильно встраиваться и экспрессироваться в клет­ках-мишенях.

Первые исследования в области генотерапии

Первоначально методика трансформации отрабатывалась на жи­вотных. В 1981 — 1982 гг. были получены трансгенные мыши, в 1985 г. аналогичные эксперименты проведены на кроликах, свиньях и овцах.

Впервые генная терапия опробована на человеке 22 мая 1989 г. с целью генетического маркирования опухоль-инфильтрующих лим­фоцитов в случае прогрессирующей мелаыомы.

Первое успешное клиническое испытание генной терапии было проведено 14 сентября 1990 г. в Бетесде, США: 4-летней девочке, стра­давшей редким (1:100 000) заболеванием — тяжелым комбинирован­ным иммунодефицитом, — которое связано с дефектом гена, кодиру­ющего аденозиндезаминазу, была введена нормальная копия гена. Лечение представляло собой поддерживающую терапию, заключав­шуюся во включении трансформированных ex vivo (ген АДА + + ген пео + ретровирусиый вектор) лейкоцитов в организм пациента в течение всей жизни с интервалом в несколько месяцев.

Существует несколько подходов к генной терапии. Последова­тельности ДНК можно вводить как в половые клетки, эмбриональ­ные, так и в соматические взрослого или ребенка.

Трансформация половых клеток предполагает передачу данного гена следующим поколениям. Соображения безопасности и этики пре­пятствуют развитию этого направления. Существует вероятность, что замена одного гена может дезорганизовать работу всего генома. С другой стороны, при достаточной изученности механизмов этого про­цесса трансформация гамет позволит ограничиться процедурой изме­нения генома одного больного, не подвергая риску врожденного забо­левания его потомство.

Генотерапия соматических клеток затрагивает только организм самого пациента и разрабатывается как основной подход. Особую роль здесь играет правильный выбор типа клеток, которые должны обеспечить максимально длительное хранение и функционирование внесенного гена.

Пути передачи гена

Разработке программы генной терапии предшествуют тщательный анализ тканеспецифической экспрессии соответствующего гена, иден­тификация первичного биохимического дефекта, исследование струк­туры, функции и внутриклеточного распределения белкового продук­та, а также биохимический анализ патологического процесса. Апроба­цию процедуры генокоррекции наследственного заболевания прово­дят на первичных культурах клеток больного, в которых в норме функционирует данный ген. На клеточных моделях оценивается эф­фективность выбранной системы переноса экзогенной ДНК, опреде­ляется экспрессия вводимой генетической конструкции, анализиру­ется ее взаимодействие с геномом клетки, отрабатываются ее способы коррекции на биохимическом уровне.

Существует два пути передачи лечебного гена.

Заместительная терапия. Если болезнь связана с отсутствием или малым количеством белкового продукта лечебного гена, то доста­точно ввести в клетку неповрежденный ген и обеспечить ему условия работы.

Корректирующая терапия. Дефектный ген заменяется нормаль-

ной копией. Этого можно достичь, основываясь на способности моле­кул ДНК к рекомбинации — обмену участками полинуклеотидных цепей в присутствии специальных ферментов.

Векторы создаются на базе различных вирусов. В 40 % случаев используются аденовирусы, включая делетированные, в 30 % — рет-ровирусы, в 16 % — аденоассоциированные вирусы, в 10 % — вирус простого герпеса, в 4 % — лентавирусы, вирус папилломы, гибридные вирусные конструкции, в том числе на базе вирусов простого герпесаи аденоассоциированного. Вирусы различаются способностью встра­иваться или не встраиваться в геном и соответственно длительной или кратковременной экспрессией в клетках, а также специфично­стью (тропизмом) к определенным тканям и органам.

Введение гена в клетку

Имеется два способа. Генетическая модификация может прово­диться непосредственно в организме больного или путем внесения функционального гена в предварительно выделенные и культивиру­емые клетки пациента, возвращенные обратно. Второй метод приме­няется чаще ввиду его эффективности.

Для переноса генов в ткани организма осуществляется обычная инъекция чистой ДНК. Предложены также другие, более прогрессив­ные методы.

Из физических методов применяется бомбардировка частицами, когда ДНК наносится на микроскопические металлические дробин­ки и выстреливается в клетку.

Достаточно эффективным способом является внесение ДНК в комплексе с липосомами — искусственными мембранными пузырь­ками, которые сливаются с плазмалеммой.

Предполагается также использовать комплексы ДНК с белками (трансферрин), для которых на поверхности клетки имеются специ­фические рецепторы, после связывания с ними чужеродная ДНК вме­сте с белком будет поглощена клеткой-мишенью.

Некоторые ученые предлагают ассоциировать плазмидную ДНК с солями и органическими полимерами (ДЭАЭ-декстран, полили­зин). Активно используется природная способность вирусов прони­кать в клетки и привносить в них собственный генетический матери­ал, на основе которого на сегодняшний день создано множество ген­но-инженерных конструкций — векторов: ретровирусные, аденовирус­ные и др.

Особое внимание уделяется созданию векторов на основе искус­ственных хромосом млекопитающих {Mammalian Artificial Chromo­somes). Благодаря наличию основных структурных элементов обыч­ных хромосом такие хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естествен­ные регуляторные элементы.

Многие лаборатории развивают невирусные подходы к доставке

генов. Это простые системы, и в них можно помещать сколько угод­но большие ДНК. Успешная доставка длинной нестабильной поли-аниопной молекулы ДНК в клетку-мишень через три липидных би-слоя, т. е. клеточную мембрану и двойную ядерную мембрану, требу­ет специальных ухищрений.

Во второй стратегии используют имитацию вирусов. В этом слу­чае ДНК вводят в комплекс с поликатионом (например, полилизи­ном), лигандом для связывания с клеткой и инициации эндоцитоза (таким лигандом может быть, например, траисферрин или антитело, специфичное к какому-либо поверхностному белку клетки) и специ­альным агентом, облегчающим высвобождение ДНК из этого ком­плекса и эндосом в цитоплазме. Такие агенты называют эндосомоли-тическими. Ими могут служить репликационно-дефектные аденови­русные частицы, включаемые в комплекс. Для увеличения безопасно­сти таких систем пытаются использовать аденовирусы животных, не­способные реплицироваться в человеческих клетках. Лиганд, введен­ный в комплекс, определяет клеточную специфичность доставки ДНК.

При некоторых достоинствах системы невирусной доставки име­ют и серьезные недостатки. Требуется очень высокая концентрация частиц, чтобы перенос гена осуществился. Пока неясно, как обстоит дело с проблемами безопасности при их использовании. До настоя­щего времени эти системы испытывались на людях только в страте­гии in vivo. Многие склонны считать, что идеальными для целей ген­ной терапии соматических клеток были бы векторы, имитирующие хромосому человека. Они могли бы быть созданы по образу и подо­бию природных хромосом, так же, например, как дрожжевые искусст­венные хромосомы — YAC. Для этого векторы должны содержать два функциональных элемента: участок, ответственный за репликацию (origin of replication), и последовательность, обеспечивающую мито-тическую стабильность, или центромеру. Полагают, что такие искус­ственные хромосомы для клеток млекопитающих появятся в ближай­шее время.