Векторы, используемые в генетической инженерии животных (на основе литических вирусов,

Ретровирусов)

Рассмотрим прямые методы трансформации клеток животных. Наи­более распространенным способом введения ДНК в культивируемые клетки млекопитающих является ее адсорбция на кристаллах фосфа­та кальция, эти частицы затем поглощаются клетками путем пиноци-тоза. Кальций-фосфатный преципитат ДНК добавляют к клеткам, прикрепленным к субстрату либо открепленным с помощью трипси­на или ЭДТА. Для получения достаточно высокой эффективности трансформации (10³ — 10⁴ трансформантов на 1 мкг специфической ДНК, например, гена tr) необходима оптимальная концентрация ДНК — около 30 мкг/мл, и поэтому к специфической ДНК, содер­жащей ген, по которому будет производиться селекция, добавляют неспецифический ДНК-носитель, например, ДНК тимуса теленка или спермы лосося.

При кальциевой процедуре 15 — 90 % клеток акцептируют ДНК. Однако, по-видимому, какая-то ее часть связывается с клеточной мем­браной и не попадает в клетку. Через несколько суток после введе­ния небольшая доля клеток уже способна экспрессировать чужерод­ные гены, однако затем уровень экспрессии падает, и относительно стабильную трансформацию (когда клеток, выживающих при данном селективном давлении, становится больше, чем гибнущих) претерпе­вает лишь 10³ — 10⁵ клеток.

Традиционным способом введения ДНК в клетки, отработанным на вирусных геномах, является метод с использованием ДЭАЭ-декст-рана. При этом повышается эффективность вхождения этой кислоты и ее временной экспрессии, но частота стабильной трансформации ниже, чем при использовании кальцийфосфатного метода.

Многие авторы используют слияние с помощью полиэтиленгли-коля культивируемых клеток с протопластами бактерий, содержащими плазмиду с эукариотным геном, или с частицами рекомбинаитного бактериофага, однако в первом случае в клетку попадает не только нужный ген в составе плазмиды, но и вся хромосомная ДНК, которая может повлиять на интеграцию и экспрессию.

Весьма перспективным в настоящее время представляется исполь­зование в опытах по генетической трансформации трансдуцирующих ретровирусных векторов, которые позволяют повысить ее эффектив­ность на несколько порядков за счет специфического (рецепторного) механизма проникновения ретровирусных частиц в клетку. Кроме того, фенотип трансформантных клонов оказывается более стабиль­ным, чем обычно, благодаря интеграции за счет ретровирусных конце­вых повторов. Разработка таких векторов рассматривается в настоя­щее время как важный шаг в направлении совершенствования мето­дов генотерапии.

Весьма эффективной, дающей высокую частоту трансформации, является методика введения ДНК путем микроинъекций в культиви­руемые соматические или зародышевые клетки. Значительная сти­муляция ее поступления (непосредственно из внеклеточной среды, без кальция или другого «облегчающего» агента) достигается при микроуколе или электрическом пробое мембраны, но эти методы пока не получили широкого распространения.

В настоящее время в руках исследователей имеется достаточно большой набор клонированных эукариотных промоторов, позво­ляющих добиваться эффективной экспрессии практически любого гена в разных типах клеток; разработаны методы быстрой проверки раз­личных конструкций типа промотор — структурный геи — термина­тор. Установлено, что для внедрения чужеродной ДНК в хромосомы клеток млекопитающих не требуется каких-либо специфических по­следовательностей этой кислоты, и интегративная рекомбинация может происходить без наличия гомологии. Это позволяет интегрировать в хромосомы путем конвекции произвольные неселектируемые гены, даже если они физически не связаны с селектируемыми. Описано также несколько примеров гомологичной застройки экзогенной ДНК, но еще требуется значительная экспериментальная работа, прежде чем удаст­ся существенно повысить специфичность интеграции и разработать сайт-специфические интегративные векторы. Перспективно в этом плане использование мобильных генетических элементов, как это было сделано в опытах с дрозофилой.

Разрабатываются подходы к конструированию автономных плаз-мидных векторов, однако эта работа тормозится недостатком фунда­ментальных знаний о контроле хромосомной и внехромосомной реп­ликации ДНК в клетках млекопитающих. Такие знания позволили бы, в частности, контролировать и увеличивать копийность автоном­ных плазмид и повышать тем самым выходы продуктов локализован­ных на них генов.

Значительный прогресс достигнут в разработке систем экспрес­сии чужеродных генов в животных, выращенных из зародышей, в которые была введена ДНК путем микроинъекций. Доказано, что фенотип животных способен изменяться за счет инъецированных генов и экспрессия может быть достигнута даже в тканях, в которых соответствующие собственные гены не работают. Показано, что вве­денные последовательности могут сохраняться у нескольких поколе­ний мышей, у которых чужеродная ДНК была интегрирована в клет­ки зародышевого пути, но уровень экспрессии при этом может и не наследоваться. Управление стабильностью наследования и экспрес­сии вводимых генов требует более глубокого изучения природы про­цессов митотической и мейотической рекомбинации в клетках млеко­питающих.

Выше затрагивался вопрос об использовании вирусов в качестве векторов для интродуцируемых генов. До самого последнего време-

ни эти векторы создавались на основе оикогенных вирусов, что огра­ничивало их применение только культурами клеток и делало мало­пригодными для опытов над целым животным, не говоря уже об ис­пользовании в медицине. Более перспективными с этой точки зрения могут быть системы, созданные на основе вируса осповакцины и па­пилломы. Так, на примере гена гормона роста человека hGH с виру­сом папилломы быка в качестве вектора показана экспрессия данного гена в клетках мыши. Синтез соматотропина под контролем металло-тионового промотора составил в этих клетках (2 -s- 6) • 10⁸ молекул в сутки, т. е. был в 10 раз выше, чем у клеток, в которые вводили ген hGH вектором SV40.