Конструирование гербицидоустойчивых растений принадлежит к числу интенсивно разрабатываемых гешю-инжеперпых проектов в области сельскохозяйственной биотехнологии. Недостаток многих гербицидов — способность воздействовать не только па сорняки, но также подавлять и многие культурные растения. К числу таковых относится наиболее широко применяемый за рубежом гербицид — гли-фосат. Он подавляет синтез ряда важнейших аминокислот и поэтому убивает не только сорняки, но и культурные виды растений, а также обладает токсичностью для бактерий и дрожжей.
Применение гербицидоустойчивых растений позволит существенно видоизменить тактику борьбы с сорняками, достигнуть заметной экономии на вспашке, обработке почвы и прополке.
Исследования последних лет, направленные на выяснение механизмов гербицидоустойчивости, позволили установить, что рассматриваемый признак у растений является моиогеиным, т. е. детерминируется чаще всего одним единственным геном. Это обстоятельство открывает возможность использовать для решения данной проблемы весь арсенал технологии рекомбииантпой ДНК.
Перспективна относительно легкая селекция на устойчивость к гербициду, добавляемому в среду, мутаитиых клеток растений в условиях культуры in vitro, а также модельных объектов типа дрожжей и бактерий. Селекционированные в таких условиях гербицидорезис-тентиые клетки могут быть регенерированы в целые растения, наделенные ценным хозяйственным признаком. На возникших в результате мутаций гербицидоустойчивых растениях или микроорганизмах можно вести исследование механизма устойчивости, а клонированные гены, детерминирующие этот признак, передавать с помощью генно-инженерных методов или обычных приемов гербицидочувствитель-ному образцу.
В настоящее время обнаружено большое количество ферментов, разрушающих те или иные гербициды. Целый ряд их получен в очищенном виде, для других клонированы индивидуальные гены, введение которых в растения, чувствительные к гербицидам, может обеспечить возникновение устойчивости при адекватной экспрессии в нужном клеточном компартменте и отсутствии цитотоксического действия его продукта в растительной клетке.
Второй аспект проблемы нейтрализации гербицидов путем их разрушения или модификации в растительной клетке — возможное накопление продуктов деградации, если последние токсичны для потре-
бителей этих рекомбинантных растений и не подвергаются деградации в самом растении или при его переработке до соединений, безвредных для человека и животных.
Устойчивость к глифосату. С химической точки зрения этот гербицид представляет собой N-фосфометилглиции. Глифосат воздействует на синтез очень важных ароматических аминокислот, точкой его приложения является фермент 5'-енолпирувилшикимат-3-фосфат-синтаза (ЕРШР-синтаза). Подавление им этого фермента вызывает дефицит ароматических аминокислот, накопление шикимата и в результате, при продолжительном контакте с глифосатом, — гибель клетки.
Известны случаи устойчивости к этому гербициду, связанные либо с повышением уровня синтеза ЕРШР-синтазы (регуляционный механизм), либо с возникновением мутантного фермента, нечувствительного к глифосату (контактный механизм). Путем мутагенеза в клетках S. typhimurium была получена ЕРШР-синтаза с единичной аминокислотной заменой пролина на серии в 101-м кодоне. Мутантный фермент обладал нормальным уровнем энзиматической активности, но был значительно меньше чувствителен к глифосату, в результате чего резко увеличивалась устойчивость бактериальных клеток к этому гербициду.
Ген ЕРШР-синтазы был встроен в вектор на основе Ti-плазмиды и интегрирован в клетки табака с последующей регенерацией из растений, устойчивых к глифосату. Его экспрессия в культурах обеспечивалась с промотора Ti. Полученные химерные клетки и регенерированные из них растения отличались повышенной устойчивостью к глифосату, причем индивидуальные клоны сильно различались по степени резистентности.
Иная стратегия экспериментов была выбрана для повышения резистентности петуньи к глифосату. Осуществлена селекция клеток ряда растений с повышенным уровнем устойчивости к нему, обусловленным увеличенной продукцией ЕРШР-синтазы. С другой стороны, был клонирован собственно растительный ген этого фермента и поставлен под более сильный промотор вируса мозаики цветной капусты. Конструкцией на основе Ti-плазмиды с таким реконструированным геном ЕРШР-синтазы были трансформированы клетки петуньи. При этом по сравнению с растениями дикого типа устойчивость к глифосату увеличилась в 10 раз. Однако при ступенчатом повышении его концентрации в среде удавалось поднять степень резистентности клеток за счет амплификации природного гена ЕРШР-синтазы.
Несмотря на приобретенную гербицидоустойчивость, химерные растения в присутствии глифосата все же несколько отставали в росте от растений исходного типа без него. Использование глифосатре-зистентных растений в интенсивных технологиях возможно лишь после дальнейшего увеличения резистентности этих культур по крайней мере вдвое.