По созданию растений, устойчивых к гербицидам

Конструирование гербицидоустойчивых растений принадлежит к числу интенсивно разрабатываемых гешю-инжеперпых проектов в области сельскохозяйственной биотехнологии. Недостаток многих гер­бицидов — способность воздействовать не только па сорняки, но так­же подавлять и многие культурные растения. К числу таковых отно­сится наиболее широко применяемый за рубежом гербицид — гли-фосат. Он подавляет синтез ряда важнейших аминокислот и поэто­му убивает не только сорняки, но и культурные виды растений, а также обладает токсичностью для бактерий и дрожжей.

Применение гербицидоустойчивых растений позволит существен­но видоизменить тактику борьбы с сорняками, достигнуть заметной экономии на вспашке, обработке почвы и прополке.

Исследования последних лет, направленные на выяснение меха­низмов гербицидоустойчивости, позволили установить, что рассмат­риваемый признак у растений является моиогеиным, т. е. детермини­руется чаще всего одним единственным геном. Это обстоятельство открывает возможность использовать для решения данной проблемы весь арсенал технологии рекомбииантпой ДНК.

Перспективна относительно легкая селекция на устойчивость к гербициду, добавляемому в среду, мутаитиых клеток растений в ус­ловиях культуры in vitro, а также модельных объектов типа дрожжей и бактерий. Селекционированные в таких условиях гербицидорезис-тентиые клетки могут быть регенерированы в целые растения, наде­ленные ценным хозяйственным признаком. На возникших в резуль­тате мутаций гербицидоустойчивых растениях или микроорганизмах можно вести исследование механизма устойчивости, а клонированные гены, детерминирующие этот признак, передавать с помощью генно-инженерных методов или обычных приемов гербицидочувствитель-ному образцу.

В настоящее время обнаружено большое количество ферментов, разрушающих те или иные гербициды. Целый ряд их получен в очи­щенном виде, для других клонированы индивидуальные гены, введе­ние которых в растения, чувствительные к гербицидам, может обеспе­чить возникновение устойчивости при адекватной экспрессии в нуж­ном клеточном компартменте и отсутствии цитотоксического действия его продукта в растительной клетке.

Второй аспект проблемы нейтрализации гербицидов путем их раз­рушения или модификации в растительной клетке — возможное на­копление продуктов деградации, если последние токсичны для потре-

бителей этих рекомбинантных растений и не подвергаются деграда­ции в самом растении или при его переработке до соединений, безвред­ных для человека и животных.

Устойчивость к глифосату. С химической точки зрения этот гер­бицид представляет собой N-фосфометилглиции. Глифосат воздей­ствует на синтез очень важных ароматических аминокислот, точкой его приложения является фермент 5'-енолпирувилшикимат-3-фосфат-синтаза (ЕРШР-синтаза). Подавление им этого фермента вызывает дефицит ароматических аминокислот, накопление шикимата и в ре­зультате, при продолжительном контакте с глифосатом, — гибель клетки.

Известны случаи устойчивости к этому гербициду, связанные ли­бо с повышением уровня синтеза ЕРШР-синтазы (регуляционный меха­низм), либо с возникновением мутантного фермента, нечувствитель­ного к глифосату (контактный механизм). Путем мутагенеза в клет­ках S. typhimurium была получена ЕРШР-синтаза с единичной ами­нокислотной заменой пролина на серии в 101-м кодоне. Мутантный фермент обладал нормальным уровнем энзиматической активности, но был значительно меньше чувствителен к глифосату, в результате чего резко увеличивалась устойчивость бактериальных клеток к это­му гербициду.

Ген ЕРШР-синтазы был встроен в вектор на основе Ti-плазмиды и интегрирован в клетки табака с последующей регенерацией из ра­стений, устойчивых к глифосату. Его экспрессия в культурах обеспе­чивалась с промотора Ti. Полученные химерные клетки и регенери­рованные из них растения отличались повышенной устойчивостью к глифосату, причем индивидуальные клоны сильно различались по сте­пени резистентности.

Иная стратегия экспериментов была выбрана для повышения ре­зистентности петуньи к глифосату. Осуществлена селекция клеток ряда растений с повышенным уровнем устойчивости к нему, обуслов­ленным увеличенной продукцией ЕРШР-синтазы. С другой стороны, был клонирован собственно растительный ген этого фермента и по­ставлен под более сильный промотор вируса мозаики цветной капус­ты. Конструкцией на основе Ti-плазмиды с таким реконструирован­ным геном ЕРШР-синтазы были трансформированы клетки петуньи. При этом по сравнению с растениями дикого типа устойчивость к глифосату увеличилась в 10 раз. Однако при ступенчатом повыше­нии его концентрации в среде удавалось поднять степень резистент­ности клеток за счет амплификации природного гена ЕРШР-синтазы.

Несмотря на приобретенную гербицидоустойчивость, химерные растения в присутствии глифосата все же несколько отставали в ро­сте от растений исходного типа без него. Использование глифосатре-зистентных растений в интенсивных технологиях возможно лишь после дальнейшего увеличения резистентности этих культур по край­ней мере вдвое.