НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ, ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ

В течение тысячелетий усилия стихийной или сознательной селек­ции были направлены на повышение количества и качества урожая, причем без знаний молекулярной основы этого процесса. Получение первых трансгенных растений, т. е. растений, в геноме которых рабо­тают чужеродные гены различного происхождения (гены бактерий, дрожжей, млекопитающих, человека, гены эволюционно далеких ви­дов растений), свидетельствует о больших возможностях генной ин­женерии в области селекции. Методология генетической инженерии растений сложнее, чем методология генетической инженерии бакте­рий. Она стала развиваться значительно позднее. Первые экспери­менты по переносу в растения чужеродных генов датируются 1980 г. Так, в 1983 г. получен каллус, а позднее — химерное растение санбин {sunflower — подсолнечник и bean — бобы), представляющее собой подсолнечник, в геноме которого работают гены запасного белка фа­соли — фазеолина.

В конце 80-х гг. получены трансгенные растения, устойчивые к гербицидам и к атаке насекомых.

Задачи и проблемы генетической инженерии растений

Основная цель генетической инженерии растений — выделение гена, определяющего полезный для культуры признак, и перенесение его в геном другой культуры, где этот новый ген должен стать частью наследственного аппарата.

Молекулярные биологи обратили внимание на растения как на объект исследования относительно недавно. Одна из причин — отсут­ствие среди них такого модельного объекта, каким стала Е. coli. Сей­час реальным кандидатом на эту роль становится двудольное расте­ние арабидопсис. Интерес, проявленный к нему молекулярными гене­тиками, объясняется очень коротким циклом его генерации, малым размером его генома и удобством для клонирования генов.

Работа с растениями имеет одно немаловажное преимущество — они могут быть регенерированы из клеточной массы (каллуса) или из

недифференцированных соматических тканей в зрелые, способные к размножению (фертильные) растения.

Однако на пути использования новой технологии гибридных ДНК возникает серьезное препятствие — это отсутствие основательных знаний о регуляции работы генов в процессе развития растения.

Понятие «генетическая инженерия растений» включает работы на клеточном уровне и учитывает все аспекты культуры клеток и тканей, молекулярную биологию и перенос генов. Основное препятствие для введения ДНК в растительные клетки — клеточная стенка. Поэтому используют растительные протопласты (отдельные растительные клет­ки, стенки которых удалены обработкой целлюлолитическими фер­ментами), аналогичные сферопластам дрожжей, которые в питатель­ной среде сохраняют жизнеспособность и при определенных услови­ях культуры образуют новые клеточные стенки с последующим деле­нием и регенерацией из них целых растений. Разработан метод слия­ния протопластов и получения на их основе соматических гибри­дов.

В настоящее время на первый план выдвигаются две проблемы. Первая — идентификация и выделение генов, предназначенных для переноса в растение с целью приобретения им нового полезного при­знака. Вторая — разработка простых и доступных методов этого переноса с последующей работой новых генов в растениях.

Методы переноса генов в растения можно разделить на две основ­ные группы: 1) с помощью векторных систем и 2) альтернативные методы прямого переноса.

Несмотря на все перечисленные сложности, генетическая инжене­рия растений вносит два существенных изменения в селекционную программу. Первое — это потенциальная экономия места и времени, поскольку получение образцов в лабораторных условиях исключает необходимость использования больших площадей для выращивания тысяч культур и может сократить время их созревания. Второе — это введение элемента точности в процесс селекции, поскольку иссле­дователь получает возможность манипулировать определенным мате­риалом в виде уже известных нуклеотидных последовательно­стей.

Агробактериальные трансформирующие

Векторы растений

Агробактерии и ризобии относятся к семейству Rhizobiaceae. Бактерии этих родов способны взаимодействовать с высшими расте­ниями, они вызывают различные новообразования. Так, после инфи­цирования культур агробактериями образуются опухоли, а штаммы ризобий — симбионты — вызывают образование корневых клубень­ков, способных осуществлять азотфиксацию у бобовых.

С проблемами генетической инженерии растений непосредствен-

но связан процесс опухолеобразоваиия. В случае агробактерий обра­зуются настоящие опухоли с неограниченным опухолевым ростом клеток хозяина. Вирулентные их штаммы вызывают три вида рака у растений: корончатый галл (Л. tumefaciens), бородатый корень (Л. rhisogenes), стеблевой галл (A. rubi). Опухоли, вызванные агро-бактериями, представляют собой типичные неоплазмы, т. е. злокаче­ственные новообразования, которые могут автономно размножаться в отсутствие бактерий. Это пока единственный пример опухолей среди растений и животных, которые вызываются бактериями.

После заражения растения агробактериями опухоли, развиваю­щиеся из одной или нескольких клеток, быстро разрастаются в круп­ные образования. Иногда па периферии таких наростов формируют­ся листовидные структуры, подобия побегов или корешков. Круг хо­зяев агробактерий чрезвычайно широк: голосемянные, большинство двудольных, некоторые однодольные (лилейные). Естественную устойчивость имеют кукуруза, пшеница, рожь, овес, рис, сахарный трост­ник, все низшие растения. В целом опухоли не убивают растения, но существенно подавляют их общий рост, жизнеспособность, повышают восприимчивость к грибным инфекциям и стрессам. Однако ряд ра­стений погибают (например, виноградная лоза).

Корончатый галл как болезнь растений описай еще Аристотелем. В 1947 г. А. Браун культивировал ткани галла на искусственной среде с сахарозой и неорганическими солями, они росли быстро даже без добавления гормонов (цитокииов и ауксинов). Оказалось, что для индукции опухоли достаточно лишь кратковременного контакта бактерий с растениями, а само ее развитие может происходить в от­сутствие бактерий, т. е. после заражения размножение опухолевых клеток происходит независимо от их присутствия. Эти наблюдения позволили Брауну заключить, что растительные клетки каким-то обра­зом трансформируются после воздействия агробактерий. На основа­нии этого было выдвинуто предположение, что бактерии вводят в хозяйскую клетку некий фактор, приводящий к перерождению нор­мальных клеток в клетки корончатого галла. Этот фактор ответстве­нен лишь за первичную индукцию опухоли, но не за ее последующее развитие. В результате его действия изменяются или полностью пре­кращаются нормальные процессы роста и дифференциации расти­тельной ткани.

В дальнейших исследованиях выявилось, что по своей химиче­ской природе опухолеобразующий фактор представляет собой нукле­иновую кислоту. Исследователи стали определять фракции ДНК, присутствующие в онкогеиных штаммах и отсутствующие в неонко-генных. Бельгийские исследователи выявили, что онкогенность агро­бактерий обусловлена присутствием в них группы ковалентио замк­нутых кольцевых плазмидных ДНК (1—2 копии в бактерии). Эти плазмиды получили обозначение Ti {tumor inducing).

В 1977 г. генетики из США доказали, что опухоли возникают в

результате включения определенного фрагмента Ti-плазмид агробак-терий в растительную ДНК. Он получил обозначение Т-ДНК (trans­fer — перенесенный), т. е. инфекционный процесс, вызванный агро-бактериями, развивается на генетическом уровне.

На основе экспериментальных данных можно представить сле­дующую картину образования корончатых галлов (рис. 4).

Agrobacterium tumefaciens

Трансформированная растительная клетка

Корончатый

галл

Рис. 4. Схема образования корончатых галлов

Агробактерии, содержащие специфические Ti-плазмиды, проникая через поврежденную, раневую ткань, заражают растения. Часть плазмидиой ДНК попадает в растительную клетку. Т-ДНК вырезается из Ti-плаз­миды и встраивается в хромосому растительной клетки. В результате фрагмент бактериальной ДНК становится частью наследственного ап­парата растения и начинает экспрессироваться наряду с генами куль­туры. Его работа запускает процесс опухолеобразования.

Во-первых, начинается неконтролируемое деление клеток, в ре­зультате чего образуется опухоль. Во-вторых, в опухолевых клетках синтезируются необычные соединения, не встречающиеся больше нигде в природе, названные опинами; по ним можно тестировать опухоле­вую клетку.

Опины (производные обычных участников метаболизма — амино­кислот и различных кетокислот или Сахаров) — биологически актив­ные соединения нового класса, обнаруживаемые только в тканях ко­рончатых галлов у растений. Эти низкомолекулярные метаболиты служат ростовыми веществами для агробактерии.

В-третьих, появляется еще одно новое свойство — гормононеза-висимый рост опухолевых растительных клеток.

Биологический смысл этого явления заключается в том, что Ti-плазмида действует как природный инструмент для переноса но­вых генов в растения, следовательно, может служить эксперименталь­ным вектором для введения любых ДНК в геном растений. Молеку­лярных биологов интересует механизм переноса и встраивания Т-ДНК в растительную хромосому. Знание этих процессов оказалось очень важным для осуществления экспериментального введения чу­жеродных генов в растения.

Векторы на основе Ti-плазмид агробактерий. Обнаружение ес­тественной системы переноса генов в растения с помощью Ti-плазмид стимулировало исследования в направлении использования их как векторов для генетической инженерии растений. Т-ДНК обладает свойствами, которые весьма желательны для универсального вектора генетической инженерии растений, а именно: широким спектром хо­зяев, эффективным способом инфекции, транскрипционной активно­стью и генетической стабильностью. Достаточно высока ее емкость: большие фрагменты чужеродной ДНК (длиной 50 тыс. пар нуклео-тидов и более), экспериментально встроенные в Т-ДНК, эффективно переносятся и внедряются в растительную хромосомную ДНК. Прежде чем природная Ti-плазмида будет использована как векторная систе­ма, ее необходимо модифицировать (рис. 5).

Х-ген

ДНК

Е. coli

A. tumefaciens

Т-ДНК

Х-ген

Т-ДНК

I

Трансгенное растение

Рис. 5. Схема клонирования чужеродного гена в растении с использованием Ti-плазмид агробактерий

Для этого первоначально ген X, который нам необходимо ввести в растения, клонируют в клетках Е. coli с использованием соответству­ющих векторных систем. Далее его в составе подходящего вектора вводят в клетки Л. tumefaciens, где происходит встраивание гена X в Ti-плазмиду, а именно в Т-сегмент. Затем такой рекомбинантной бак­терией обрабатывают клетки растений, где Т-ДНК, несущая ген X, встраивается в ядерную ДНК растительной клетки. В результате кло-

иирования таких рекомбинаитных растительных клеток с последую­щим регенерированием из них растений получаются трансгенные ра­стения, в геноме которых работает чужеродный геи X (см. рис. 5).