Другие векторные системы, используемые в генетической инженерии растений

Наряду с Ti-плазмидами интенсивно разрабатываются векторы па основе ДНК органелл растительной клетки — хлоропластов и мито­хондрий. Это перспективный подход, ибо в отличие от других типов внехромосомных генетических элементов мтДНК может быть полу­чена из любого эукариотического организма. Кроме того, в митохонд­риях растений помимо основной молекулы мтДНК найдены неболь­шие плазмидоподобные мтДНК. Эта кислота так же, как и хлоропла-стная ДНК, имеет множество гомологичных областей с ядерной ДНК, что делает возможным обмен или внедрение ДНК оргаиелл в ядер­ную ДНК растения.

Транспозируемые элементы, или транспозоны, — это сегменты ДНК, которые сами контролируют свою собственную транспозицию (пере­мещение) из исходного сайта и интеграцию (внедрение) в новый сайт хромосомы (или плазмиды). Их применяют для введения новых ге­нов в растения, подобно тому, как ретровирусы используют в качестве векторных систем для встраивания генов в животные клетки. Основ­ное преимущество этих векторов — возможность их использования в экспериментах с однодольными растениями.

Рассмотрим, какие возможности для генетической инженерии ра­стений таят в себе вирусы и вироиды, поражающие культуры. Типич­ным представителем переноса генов в растения является фитови-рус — вирус мозаики цветной капусты. Он вызывает мозаичное забо­левание листьев преимущественно у крестоцветных. Симптомы ин­фекции проявляются через 2 — 3 недели. Использовать этот патоген в качестве вектора можно следующим образом. Основная задача — это включение необходимого гена X в состав вирусной ДНК и затем использование способности патогена размножаться и копировать свою ДНК в клетке, с тем чтобы вместе с увеличением числа копий вирус­ной ДНК происходил рост и числа копий гена X. Кроме того, внедре­ние последнего должно быть безболезненным для самого вируса, по­скольку после внедрения он должен сохранить способность разви­вать инфекционный процесс в растении.

Стебли турнепса были инфицированы таким химерным вирусом, у которого вирусная ДНК содержала бактериальный ген устойчиво­сти к яду — метотрексату. При размножении в клетках зараженного растения этого вируса размножался и бактериальный ген, в результа­те экспрессии которого в культуре образовался фермент, обусловли­вающий устойчивость к метотрексату.

Преимущества вирусных векторов:

1) легче вводить в растения, чем Ti-плазмиды;

2) вирус не только размножается в инфицированной клетке, но и
переносится в различные органы растения, где накапливается огром­
ное число копий вирусного генома и соответственно столько же ко­
пий чужеродного гена X; в результате обеспечивается сверхсиитез
продукта, кодируемого этим геном.

Среди их недостатков можно отметить:

1) небольшую емкость вирусного вектора (в Т-ДНК — большие
фрагменты чужеродной ДНК, а в вирусной ДНК — менее 800 пар
иуклеотидов или один небольшой ген);

2) ограниченность круга поражаемых растений.

В 1971 г. выяснилось, что веретенообразиость клубней вызывают небольшие неиикапсулированиые молекулы автономно удваивающейся РНК. Так были открыты вироиды — очень короткие цепи одиоиите-вой ковалеитио связанной кольцевой РНК, состоящие всего лишь из 270 — 300 иуклеотидов. В отличие от вирусов они не заключены в белковую оболочку. Все известные вироиды инфицируют своих хозя­ев персистеитио, т. е. не происходит выздоровления растения, и могут быть выделены из инфицированных культур в продолжение всего их жизненного цикла. Они заражают картофель, томаты, огурцы, вино­град, кокосовую пальму и др. Вироиды вызывают системную инфек­цию растений, т. е. могут мигрировать из сайта внедрения в другие его части, переносятся механически или через клеточный сок. Они связаны с ядерными фракциями растения и могут размножаться в ядрах. Поскольку вироиды содержат не ДНК, а РНК, методика рабо­ты с ними заключается в следующем. Сначала получают одноиитевую ДНК-копию с вироидной РНК. Затем достраивают вторую, компле­ментарную, нить, получая кДНК, с которой и проводят манипуля­ции.

Методы прямого переноса чужеродной ДНК

В клетках растений

К методам прямого переноса относятся микроинъекция, электро-порация, упаковка в липосомы, прямая трансформация, слияние про­топластов. Во всех случаях голую ДНК, несущую ген X, вводят в протопласты растения. Ее инкубируют с большой популяцией расти­тельных клеток-мишеней в присутствии полиэтилеигликоля. При этом 1 из 10⁵ клеток оказывается трансформированной. Применяя метод кокультивирования, совместно культивируют протопласты с агробакте-риями. В результате ген X оказывается встроенным в геном расти­тельных протопластов — это искусственная индукция опухолеобра-зоваиия.

Метод микроинъекций: ДНК, содержащую чужеродные гены, че­рез микроиглы вводят в цитоплазму или в ядро протопласта, зафик-

сировашюго специальным устройством. В результате чужеродная ДНК интегрируется в геном растительного протопласта.

Электропорация — это введение ДНК в клетки с помощью высо­ковольтных электрических импульсов, способствующих более успеш­ному ее проникновению через мембрану. При этом кислота поглоща­ется сразу или после электрического шока через поры в клеточных мембранах.

Метод упаковки ДНК в липосомы — это инкапсулирование чу­жеродной ДНК в сферические тельца, состоящие из фосфолипидов (липосомы).

Преимущества:

1) низкая токсичность липосом для растительной клетки;

2) обеспечение сохранности чужеродной ДНК (отсутствие воз­
действия на нее иуклеаз);

3) высокая эффективность введения ДНК;

4) возможность обрабатывать многие виды растений.

Анализ потомства траисгеппых растений путем скрещивания по­казывает, что новые для них гены, введенные с помощью различных методов генетической инженерии, сохраняются у потомства и переда­ются далее при следующих генерациях согласно законам Менделя, т. е. так же, как и свои гены.