Общая характеристика интерферонов и интерлейкинов. Их использование. Цитокины (лимфокины и монокины) — большая группа белков с молекулярной массой 15 — 20 к Да, вырабатываемых иммунными клетками высших млекопитающих, в том числе и человека. Они обеспечивают правильное взаимодействие между различными клетками и тканями организма. Многие из изученных цитокинов являются колониестимулирующими, или ростовыми, факторами. Другие, к которым, в частности, относятся интерфероны и интерлейкины, участвуют в осуществлении специфических иммунных реакций. Цитокины — потенциальные лечебные препараты, область применения которых возрастает с каждым годом.
Одними из наиболее изученных групп данных белков являются интерлейкины и интерфероны. Интерлейкины — это сравнительно короткие (около 150 аминокислотных остатков) полипептиды, участвующие в организации иммунного ответа. Они объединяют две группы, внутри каждой из которых выделяют еще ряд подгрупп. Интер-лейкин-1 образуется определенной группой лейкоцитов крови — макрофагами — в ответ на введение антигена. Он стимулирует размножение других субпопуляций иммунных клеток. Т-хелпер в свою очередь вырабатывает интерлейкин-2, который стимулирует развитие В-лимфоцитов, Т-киллеров и т. д. Под действием интерлейкинов-2 данные субпопуляции вырабатывают другие лимфокины, регулирующие иммунный ответ.
Иптерферопы — это группа белковых веществ, вырабатываемых в организме в ответ на проникновение вируса. Они делятся на три группы. Лейкоцитарный интерферон (а-интерферон) образуется при воздействии вирусов на лейкоциты, фибробластный (р-иитерфе-рон) — при воздействии на фибробласты, иммунный (у-интерфе-рон) — Т-лимфоцитами в ответ на воздействие вируса. В свою очередь каждая из этих групп включает несколько белков. Все известные интерфероны типа а у человека не содержат сахарных остатков, тогда как р- и у-интерфероны гликозилированы. Интерфероны р и а содержат по 166 аминокислотных остатков, а также участвующие в мембранном транспорте лидерные пептиды — соответственно 21 или 23 аминокислотных остатков. а-Интерфероны кодируются семейством из 13 генов, р- и у-интерфероиы — единственным геном.
Интерфероны и интерлейкины используются как основные лечебные средства при иммунных расстройствах. Кроме того, первые применяют для лечения болезней, вызываемых вирусами герпеса, бешенства, гепатитов, цитомегаловирусом, вирусом, поражающим сердце, а также для профилактики вирусных инфекций. Также они оказывают лечебное воздействие на организм больных раком и рассеянным склерозом.
Генно-инженерные подходы к синтезу интерферонов. Возможности получения усовершенствованных цитокинов. На практике а-интерферон извлекают из лейкоцитов при низкоскоростном центрифугировании свежевыделенной крови человека. Лейкоциты переносят в культуральную жидкость, содержащую либо сыворотку крови человека, либо казеин молока. В среду вносят вирус-интерфероно-ген (вирус Сендай или вирус ныокаслской болезни), выдерживают в течение ночи, после чего лейкоциты отделяют центрифугированием, вирус инактивируют любым из приемлемых способов. Супериатант (от лат. supernatans — плавающий на поверхности), или надосадок, представляет собой нативный интерферон. Его лиофильно высушивают и выпускают в ампулах. Это пористый, серовато-коричневый порошок, легко растворимый в воде. Растворенный препарат имеет розовато-красноватый цвет и слегка опалесцирует. Из нативного интерферона можно получить концентрированный препарат путем очистки колоночной хроматографией на сефадексах. После высушивания он имеет вид пористого порошка серовато-белого цвета, хорошо растворим в воде.
Р-Интерферон получают из фибробластов, выращенных в мо-нослойной культуре, индуцированной синтетическим фрагментом полиА-полии в присутствии циклогексимида и актиномицина Д. Обычно интерфероны продуцируются в малых количествах (около 1 мг на 10 л тканевой культуральной жидкости), и к тому же после 48 — 72 ч клетки-продуценты отмирают. Вот почему производство лейкоцитарных интерферонов относят к разряду дорогостоящих и экономически мало выгодных. Поэтому успешно завершившиеся
работы по генно-инженерному интерферону помогли решить и эти проблемы. В начале 80-х гг. XX в. британская фирма Wellcome Foundation LTD передала на клинические испытания природную смесь а-иитерферонов, полученную в глубинной суспензионной культуре ви-русоипдуцироваипых человеческих лимфобластов. Препарат был назван велфероном. Выпускается в виде стерильной, прозрачной, бесцветной жидкости по 1 мл (3 медицинские единицы). К 1988 г. уже три фирмы производили а-иптерфероны.
Технологическая схема получения генно-инженерных иптерфе-ронов (как одна из возможных) принципиально сводится к следующему:
1) индукция синтеза и выделение иитерфероиовой мРНК из кле
ток;
2) получение к ДНК, комплементарной иптерфероиовой мРНК из
лейкоцитов;
3) встраивание кДНК в плазмиду;
4) введение реконструированной плазмиды в клетки Е. coli\
5) размножение бактерий, содержащих реконструированную плаз
миду, в культуралыюй среде;
6) сепарирование клеток Е. coli\
7) дезинтеграция и экстракция клеток Е. coli\
8) осаждение (например, полиэтиленамином) с последующим цен
трифугированием;
9) высаливание интерферона из супериатанта аммония сульфа
том;
10) диализ осадка интерферона;
11) растворение интерферона, пропускание раствора через колон
ку с иммуносорбентом (пришитыми моноклональными антителами);
12) элюция интерферона с последующей хроматографией на цел
люлозном катионообменнике.
Из указанных 12 стадий только 8 последних фактически реализуются в производственных условиях, тогда как первые 4 стадии выполняются в лабораториях.
В первых успешных экспериментах встраивание кДНК в Е. coli приводило к образованию около 50 молекул интерферона на каждую бактериальную клетку. Затем путем точного встраивания интерферо-новой кДНК рядом с соответствующим бактериальным промотором удалось добиться более высокого уровня экспрессии. Одна из наиболее эффективных конструкций, образованных при слиянии сегмента ДНК, доходящего до инициаторного кодона и содержащего промотор лактозного оперона, — с последовательностью, кодирующей зрелый человеческий интерферон. Это привело к увеличению количества данного белка, продуцируемого бактериальной клеткой, более чем в 1 000 раз.
Бактерии с генами интерферона человека вырабатывают специфический белок в количестве 200 — 250 мкг/л бактериальной суспензии. Кроме того, удается получать человеческий интерферон с
помощью В, subtilis, способной секретировать синтезируемые белки в окружающую среду, а также с помощью Saccharomyces cerevisiae, растущих на средах с более дешевыми субстратами, на них не действуют фаги, они крупнее бактерий и легче сепарируются, в их клетках осуществляется процессипг преиптерферопов. Применяют также культуры бактерий из родов Methylomonas, Pseudomonas, Salmonella. Все названные микроорганизмы конститутивно (не адаптивно) образуют иптерферопы, не отличающиеся от природных. Против всех классов этих белков получены мопоклональные антитела, с помощью которых проводят быструю и высококачественную очистку продуктов, применяя иммуноафипную хроматографию.
Иитерфероиы р и у также были получены в трапсгенпых клетках, однако при этом были использованы эукариотические клетки, поскольку прокариотические клетки не имеют систем гликозилироваиия. В качестве продуцентов использовали ооциты лягушки, клетки почек китайского хомячка, клетки дрозофилы, дрожжи и т. д,
Бактериальный интерферон легко очистить, он получен в кристаллической форме и использован в эксперименте на обезьянах. Было показано, что он нетоксичен, поэтому такие испытания провели на людях. В настоящее время предложено множество аспектов использования геппо-ииженерного а-интерферона. Его разновидности в некоторой степени отличаются по действию па клетки различного происхождения. Эта разница локализуется на генном уровне. Если каждый из соответствующих генов разрезать в определенном месте и выделить вариабельный фрагмент, а затем сшить эти части, то можно получить гибридные гены, которые после трансформации клеток реципиентов будут программировать синтез гибридных иитерферонов. Последние были получены, и показано, что в ряде случаев свойства гибридов резко отличаются от свойств исходных иитерферонов.
Генно-инженерные подходы к получению интерлейкинов. В целом схемы получения интерлейкинов и интерферона генно-инженерным методом приблизительно сходны. Отличие заключается в индукторе. На первом этапе моноциты обрабатывают лейкополисаха-ридами (эндотоксинами) грамотрицательных бактерий. Далее из моноцитов выделяют мРНК, из которой вырезают интроны. Экзоны сшивают при помощи лигазы и сшитый фрагмент обрабатывают ре-вертазой с получением кДНК. На следующем этапе проводится идентификация интерлейкина этой кислоты при помощи гибридизацион-ного анализа. Далее его встраивают в фаг А, которым трансформируют клетки Е. coli. На следующем этапе трансформированные клетки размножают при 28 °С, а наработку интерлейкина ведут при 42 °С. Затем проводятся его выделение и очистка.