Получение интерферонов и интерлейкинов генно-инженерными методами

Общая характеристика интерферонов и интерлейкинов. Их использование. Цитокины (лимфокины и монокины) — большая груп­па белков с молекулярной массой 15 — 20 к Да, вырабатываемых иммунными клетками высших млекопитающих, в том числе и челове­ка. Они обеспечивают правильное взаимодействие между различны­ми клетками и тканями организма. Многие из изученных цитокинов являются колониестимулирующими, или ростовыми, факторами. Дру­гие, к которым, в частности, относятся интерфероны и интерлейкины, участвуют в осуществлении специфических иммунных реакций. Ци­токины — потенциальные лечебные препараты, область применения которых возрастает с каждым годом.

Одними из наиболее изученных групп данных белков являются интерлейкины и интерфероны. Интерлейкины — это сравнительно короткие (около 150 аминокислотных остатков) полипептиды, уча­ствующие в организации иммунного ответа. Они объединяют две груп­пы, внутри каждой из которых выделяют еще ряд подгрупп. Интер-лейкин-1 образуется определенной группой лейкоцитов крови — мак­рофагами — в ответ на введение антигена. Он стимулирует раз­множение других субпопуляций иммунных клеток. Т-хелпер в свою очередь вырабатывает интерлейкин-2, который стимулирует развитие В-лимфоцитов, Т-киллеров и т. д. Под действием интерлейкинов-2 данные субпопуляции вырабатывают другие лимфокины, регулирую­щие иммунный ответ.

Иптерферопы — это группа белковых веществ, вырабатываемых в организме в ответ на проникновение вируса. Они делятся на три группы. Лейкоцитарный интерферон (а-интерферон) образуется при воздействии вирусов на лейкоциты, фибробластный (р-иитерфе-рон) — при воздействии на фибробласты, иммунный (у-интерфе-рон) — Т-лимфоцитами в ответ на воздействие вируса. В свою оче­редь каждая из этих групп включает несколько белков. Все извест­ные интерфероны типа а у человека не содержат сахарных остатков, тогда как р- и у-интерфероны гликозилированы. Интерфероны р и а содержат по 166 аминокислотных остатков, а также участвующие в мембранном транспорте лидерные пептиды — соответственно 21 или 23 аминокислотных остатков. а-Интерфероны кодируются семейством из 13 генов, р- и у-интерфероиы — единственным геном.

Интерфероны и интерлейкины используются как основные лечеб­ные средства при иммунных расстройствах. Кроме того, первые при­меняют для лечения болезней, вызываемых вирусами герпеса, бешен­ства, гепатитов, цитомегаловирусом, вирусом, поражающим сердце, а также для профилактики вирусных инфекций. Также они оказывают лечебное воздействие на организм больных раком и рассеянным скле­розом.

Генно-инженерные подходы к синтезу интерферонов. Возмож­ности получения усовершенствованных цитокинов. На практике а-интерферон извлекают из лейкоцитов при низкоскоростном цент­рифугировании свежевыделенной крови человека. Лейкоциты пере­носят в культуральную жидкость, содержащую либо сыворотку кро­ви человека, либо казеин молока. В среду вносят вирус-интерфероно-ген (вирус Сендай или вирус ныокаслской болезни), выдерживают в течение ночи, после чего лейкоциты отделяют центрифугированием, вирус инактивируют любым из приемлемых способов. Супериатант (от лат. supernatans — плавающий на поверхности), или надосадок, представляет собой нативный интерферон. Его лиофильно высуши­вают и выпускают в ампулах. Это пористый, серовато-коричневый порошок, легко растворимый в воде. Растворенный препарат имеет розовато-красноватый цвет и слегка опалесцирует. Из нативного интерферона можно получить концентрированный препарат путем очи­стки колоночной хроматографией на сефадексах. После высушива­ния он имеет вид пористого порошка серовато-белого цвета, хорошо растворим в воде.

Р-Интерферон получают из фибробластов, выращенных в мо-нослойной культуре, индуцированной синтетическим фрагментом полиА-полии в присутствии циклогексимида и актиномицина Д. Обычно интерфероны продуцируются в малых количествах (около 1 мг на 10 л тканевой культуральной жидкости), и к тому же после 48 — 72 ч клетки-продуценты отмирают. Вот почему производство лейкоцитарных интерферонов относят к разряду дорогостоящих и экономически мало выгодных. Поэтому успешно завершившиеся

работы по генно-инженерному интерферону помогли решить и эти проблемы. В начале 80-х гг. XX в. британская фирма Wellcome Foundation LTD передала на клинические испытания природную смесь а-иитерферонов, полученную в глубинной суспензионной культуре ви-русоипдуцироваипых человеческих лимфобластов. Препарат был назван велфероном. Выпускается в виде стерильной, прозрачной, бес­цветной жидкости по 1 мл (3 медицинские единицы). К 1988 г. уже три фирмы производили а-иптерфероны.

Технологическая схема получения генно-инженерных иптерфе-ронов (как одна из возможных) принципиально сводится к следую­щему:

1) индукция синтеза и выделение иитерфероиовой мРНК из кле­
ток;

2) получение к ДНК, комплементарной иптерфероиовой мРНК из
лейкоцитов;

3) встраивание кДНК в плазмиду;

4) введение реконструированной плазмиды в клетки Е. coli\

5) размножение бактерий, содержащих реконструированную плаз­
миду, в культуралыюй среде;

6) сепарирование клеток Е. coli\

7) дезинтеграция и экстракция клеток Е. coli\

8) осаждение (например, полиэтиленамином) с последующим цен­
трифугированием;

9) высаливание интерферона из супериатанта аммония сульфа­
том;

10) диализ осадка интерферона;

11) растворение интерферона, пропускание раствора через колон­
ку с иммуносорбентом (пришитыми моноклональными антителами);

12) элюция интерферона с последующей хроматографией на цел­
люлозном катионообменнике.

Из указанных 12 стадий только 8 последних фактически реали­зуются в производственных условиях, тогда как первые 4 стадии вы­полняются в лабораториях.

В первых успешных экспериментах встраивание кДНК в Е. coli приводило к образованию около 50 молекул интерферона на каждую бактериальную клетку. Затем путем точного встраивания интерферо-новой кДНК рядом с соответствующим бактериальным промотором удалось добиться более высокого уровня экспрессии. Одна из наибо­лее эффективных конструкций, образованных при слиянии сегмента ДНК, доходящего до инициаторного кодона и содержащего промотор лактозного оперона, — с последовательностью, кодирующей зрелый че­ловеческий интерферон. Это привело к увеличению количества данно­го белка, продуцируемого бактериальной клеткой, более чем в 1 000 раз.

Бактерии с генами интерферона человека вырабатывают специ­фический белок в количестве 200 — 250 мкг/л бактериальной сус­пензии. Кроме того, удается получать человеческий интерферон с

помощью В, subtilis, способной секретировать синтезируемые белки в окружающую среду, а также с помощью Saccharomyces cerevisiae, ра­стущих на средах с более дешевыми субстратами, на них не действу­ют фаги, они крупнее бактерий и легче сепарируются, в их клетках осуществляется процессипг преиптерферопов. Применяют также куль­туры бактерий из родов Methylomonas, Pseudomonas, Salmonella. Все названные микроорганизмы конститутивно (не адаптивно) образуют иптерферопы, не отличающиеся от природных. Против всех классов этих белков получены мопоклональные антитела, с помощью которых проводят быструю и высококачественную очистку продуктов, приме­няя иммуноафипную хроматографию.

Иитерфероиы р и у также были получены в трапсгенпых клетках, однако при этом были использованы эукариотические клетки, посколь­ку прокариотические клетки не имеют систем гликозилироваиия. В качестве продуцентов использовали ооциты лягушки, клетки почек китайского хомячка, клетки дрозофилы, дрожжи и т. д,

Бактериальный интерферон легко очистить, он получен в крис­таллической форме и использован в эксперименте на обезьянах. Было показано, что он нетоксичен, поэтому такие испытания провели на людях. В настоящее время предложено множество аспектов исполь­зования геппо-ииженерного а-интерферона. Его разновидности в не­которой степени отличаются по действию па клетки различного про­исхождения. Эта разница локализуется на генном уровне. Если каж­дый из соответствующих генов разрезать в определенном месте и выделить вариабельный фрагмент, а затем сшить эти части, то можно получить гибридные гены, которые после трансформации клеток ре­ципиентов будут программировать синтез гибридных иитерферонов. Последние были получены, и показано, что в ряде случаев свойства гибридов резко отличаются от свойств исходных иитерферонов.

Генно-инженерные подходы к получению интерлейкинов. В целом схемы получения интерлейкинов и интерферона генно-инже­нерным методом приблизительно сходны. Отличие заключается в индукторе. На первом этапе моноциты обрабатывают лейкополисаха-ридами (эндотоксинами) грамотрицательных бактерий. Далее из мо­ноцитов выделяют мРНК, из которой вырезают интроны. Экзоны сшивают при помощи лигазы и сшитый фрагмент обрабатывают ре-вертазой с получением кДНК. На следующем этапе проводится иден­тификация интерлейкина этой кислоты при помощи гибридизацион-ного анализа. Далее его встраивают в фаг А, которым трансформиру­ют клетки Е. coli. На следующем этапе трансформированные клетки размножают при 28 °С, а наработку интерлейкина ведут при 42 °С. Затем проводятся его выделение и очистка.