МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ

В генетической инженерии для конструирования рекомбинант-иых ДНК используется множество различных ферментов. В клетке межнуклеотидиые связи в ДНК и РНК расщепляются нуклеазами. В генетической инженерии используют эндонуклеазы рестрикции — рестриктазы. Эти ферменты распознают в молекулах ДНК опреде­ленные нуклеотидные последовательности из четырех, пяти или ше­сти остатков и поэтому расщепляют эту кислоту на сравнительно небольшое число строго определенных фрагментов.

Еще в 1953 г. было обнаружено, что ДНК определенного штамма Е. coli, введенная в клетки другого штамма (например, ДНК штамма В в клетки штамма С), не проявляет, как правило, генетической актив­ности, так как быстро расщепляется на мелкие фрагменты. В 1966 г. установлено, что это явление связано со специфической модификацией хозяйской ДНК: она содержит несколько метилированных основа-

ний, отсутствующих в иемодифицированиой ДНК, причем метилиро­вание (добавление к основанию метилыюй группы — СН₃) происхо­дит уже после завершения репликации. Таким образом, клетка-хозя­ин как бы метит свою ДНК по определенной последовательности, а чужую ДНК расщепляет, узнав, что эти же последовательности не мечены.

В 1969 г. были открыты специфический модифицирующий фер­мент, метилирующий ДНК, и рестриктаза, которая расщепляла неме-тилированную ДНК. Однако этот фермент не был высокоспецифи-чеи по отношению к определенной последовательности этой кисло­ты. Вскоре была выделена первая рестриктаза, которая расщепляла строго определенную последовательность ДНК.

Рестриктазы принято именовать по названию бактерий, из кото­рых их выделяют. Так, название EcoRl свидетельствует о том, что этот фермент получен из Escherichia coli. Первая из трех букв аббре­виатуры соответствует первой букве названия рода (Е). Последую­щие две буквы являются начальными буквами видового названия (со). Следующая буква (R) говорит о том, из какого штамма выделен фер­мент. Римская цифра соответствует порядковому номеру рестрикта­зы в ряду аналогичных ферментов, выделенных из этого микроорга­низма (например, EcoRI, EcoRII). Каждый фермент узнает опреде­ленную 4 — 7-члеиную последовательность в двухцепочечиой ДНК. Разрезание последней по этим сайтам приводит к образованию либо тупых (например, при действии рестриктазы Hpal), либо липких, т. е. перекрывающихся (например, BamHI), концов. Для конструирова­ния гибридных молекул особенно удобны последние (см. ниже). Если допустить, что нуклеотиды распределены по молекуле ДНК совер­шенно случайным образом, можно рассчитать частоту встречаемости участка узнавания для данной рестриктазы. В каждой нуклеотидной позиции молекулы ДНК с одинаковой вероятностью может оказаться один из 4 нуклеотидов (A, G, С, Т), поэтому фермент, узнающий четы-рехзвенную последовательность, будет находить одну мишень на 256 пар оснований (4⁴). В то же время фермент, различающий шести-звенную последовательность, определит специфический участок узна­вания 1 раз на 4 096 пар оснований (4⁶). Любой фрагмент ДНК обладает характерным расположением сайтов узнавания различных рестриктаз, что позволяет строить так называемые рестриктазные кар­ты. Небольшие геномы, например геномы вирусов, митохондрий, хло-ропластов, или части крупных геномов могут быть таким образом расщеплены на определенное число рестрикционных фрагментов.

Поясним это на примере модели. Пусть наш геном состоит из сле­дующих генов: abcdefgh. Под действием рестриктазы I он расщепля­ется на фрагменты abc defgh, а под действием рестриктазы II — на abed efgh.

Уже из сравнения этих двух наборов фрагментов можно устано­вить их последовательность в геноме. Легко понять, что компонент b

расположен после а, так как оба они содержатся в одном общем фрагменте abc, а компонент d расположен после с, так как оба они появляются в одном фрагменте bed, и т. д. В дальнейшем эти фраг­менты можно выделить, чтобы определить, каким генам и (или) регу-ляторным участкам они соответствуют. Их также можно использо­вать, чтобы синтезировать гетерологичные рекомбинантные молеку­лы, встроив, например, какой-либо фрагмент в плазмиду и размножив его с помощью Е. coli. Получение коротких фрагментов ДНК необ­ходимо и для установления последовательности оснований в более крупных фрагментах.

Рестриктазы бывают мелко- и крупнощепящими. Первые узнают тетрануклеотид и вносят в молекулы гораздо больше разрывов, чем вторые, распознающие последовательность из шести нуклеотидных пар. Это связано с тем, что вероятность встречаемости определенной последовательности из четырех нуклеотидов гораздо выше, чем из шести. Например, в ДНК бактериофага 17, состоящей из 40 000 пар оснований, отсутствует последовательность, узнаваемая рестриктазой RI из Е. coli. Рестриктазы по-разному расщепляют ДНК: одни вно­сят разрывы по оси симметрии узнаваемой последовательности, а дру­гие — со сдвигом с образованием «ступеньки». В первом случае обра­зуются так называемые тупые концы, а во втором — липкие, т. е. фрагменты имеют на своих концах однонитевые взаимно комплемен­тарные участки длиной в четыре нуклеотида. Последние удобны для создания рекомбинантных ДНК. К первым относится рестриктаза EcoRI из Е. coli, действующая по следующему механизму:

EcoRI

GAATTC CTTAAG

Ко вторым — рестриктаза Alul из Arthrobacter luteus, действующая по следующему механизму:

Alul

AGCT AG СТ

TCGA. ТС, GA

тупые концы

Для создания рекомбинантных ДНК используют также РНК-за­висимые ДНК-полимеразы (обратные транскриптазы, ревертазы), син­тезирующие ДНК на матрице мРНК. Применяются и ферменты, со­единяющие концы фрагментов ДНК, т. е. ДНК-лигазы, выделяемые из Е. coli и фага Т4: Для изменения структуры концов фрагментов ДНК используют нуклеазу BamI, экзонуклеазу III из E.coli, нуклеазу SI из Aspergillus orysae. Субстратом для таких ферментов являются однотяжевые РНК и ДНК, двутяжевые ДНК, которые распадаются до 5'-фосфорилированных олигонуклеотидов и нуклеозид-5'-фосфа-тов. Для приготовления гибридизационных проб используется ДНК-полимераза I из Е. coli.

Ковалентное соединение (в дальнейшем мы будем называть тер­мином «лигирование») липких концов фрагментов ДНК — процеду­ра технически несложная, однако в этом случае могут возникать про­блемы. Так, липкие концы вектора могут лигироваться сами на себя без включения клонируемого фрагмента. Кроме того, может произой­ти отжиг таких концов двух различных фрагментов, что приведет к образованию гетерогенной вставки. Не все интересующие исследова­теля участки ДНК содержат удобно расположенные сайты узнавания для рестриктаз, дающих липкие концы. Для преодоления этих труд­ностей иногда используют рестриктазы, образующие тупые концы, после чего с помощью специфического фермента (терминальной трансфе-разы) генерируют новые концы. Так, присоединение к З'-концам век­тора гомополимерной цепочки, состоящей из dG, а к З'-концам клони­руемого фрагмента ДНК — цепочки polyd(C)обеспечивает исклю­чительно межмолекулярный отжиг. В ходе этой процедуры, получив­шей название «присоединение гомополимерного хвоста», образуется также сайт для рестриктазы Smal, что обеспечивает возможность по­следующего вырезания клонированного фрагмента. Иногда к тупо­конечной ДНК присоединяют синтетические олигонуклеотидные лин­керы, содержащие участки узнавания для определенных рестриктаз. С использованием ДНК-лигазы бактериофага Т4 можно проводить непосредственное лигирование тупых концов.

Существует три способа конструирования рекомбинант­ных ДНК. Первый — объединение ДНК-фрагментов по липким концам. Как мы уже говорили, некоторые рестриктазы способны обра­зовывать их при специфическом разрезании ДНК. Используя это, необходимый ген выделяют из нее при помощи какой-либо рестрик­тазы. Ею же обрабатывают ту ДНК, к которой хотят присоединить ген. В результате как на выделенном гене, так и на другой ДНК образуются комплементарные липкие концы (рис. 2) (по кн.: Сель­скохозяйственная биотехнология, 1998).

Второй способ — коннекторный. Существуют рестриктазы, обра­зующие при специфическом расщеплении ДНК тупые концы. Для гена, полученного таким образом, необходимо пришить липкие концы. Это достигается приливанием, например, смеси аденозина или тимина.

Линейная молекула

плазмидной ДНК

с липкими концами

Рестриктаза EcoRI

АЛТТ

тт ал

Фрагмент ДНК человека,

полученный в результате

расщепления той же рестриктазой и

имеющий те же липкие концы, что и

расщепленная ДНК плазмиды

Молекула плазмидной ДНК со

встроенным фрагментом ДНК человека

(рекомбинантная молекула ДНК)

Рис. 2. Использование рестриктаз для конструирования рекомбинантных или химерных молекул ДНК. Введенная обратно в бактериальную клетку (при трансфор­мации) плазмида реплицируется, а вместе с ней реплицируется и последовательность-вставка. Поскольку воссоединение липких концов реконструирует сайт узнавания ре-стриктазы, клонированный фрагмент может быть легко выделен из рекомбинантной плазмиды при помощи той же рестриктазы. Если при этом использовать смесь всех фрагментов, образованных в результате расщепления тотальной ДНК человека одной и той же эндонуклеазой, то при помощи клонирующих плазмид можно получить около миллиона различных рекомбинантных молекул ДНК, каждая из которых дает начало индивидуальному бактериальному клону

Третий способ, линкерный, предполагает, что при необходимости тупые концы могут быть превращены в липкие. Для этого к первым присоединяют двухцепочечные последовательности (линкеры) с уча­стками узнавания рестриктазы, дающей липкие концы.