ИДЕНТИФИКАЦИЯ КЛЕТОК-РЕЦИПИЕНТОВ, НЕСУЩИХ ГЕН-МИШЕНЬ

Завершающим этапом молекулярного клонирования является идентификация тех клеток-реципиентов, которые несут встроенный ген-мишень. Эффективность выбранного метода отбора определяет успех генно-инженерного проекта. Необходимо при этом учитывать, что не все клетки являются трансформированными и несут необхо­димый ген. Поэтому отбор обычно проводят в два этапа.

На первом этапе отбирают клетки, несущие соответствующий век­тор, использованный для переноса генетической информации. Чаще всего клетки-реципиенты выделяют по тем маркерам, которые песет встроенный вектор. В случае применения в качестве вектора плазми-ды pBR322, которая несет два гена устойчивости к антибиотикам, отбор трансформированных клеток можно вести на агаризовашюй среде, содержащей ампициллин или тетрациклин, в которой эти клет­ки формируют колонии, и дальнейший отбор проводят уже среди них.

Помимо обнаружения клеток, трансформированных соответству­ющим вектором, существует необходимость отобрать среди них те, которые не только несут вектор, но и нужный ген — ген-мишень. Поэтому по завершении первого этапа идентификации приступают ко второму, на котором используют две группы методов, описанных ниже.

1. Методы, основанные на непосредственном анализе ДНК кле­ток-реципиентов. Определение гена-мишени проводят двумя спосо­бами:

а) прямое определение нуклеотидной последовательности ДНК
(по методу Максама — Гилберта или по методу Сенгера);

б) гибридизационный анализ с соответствующей ДНК/РНК.

2. Методы, основанные на выявлении признака, кодируемого ге-пом-мишеиыо:

а) иммунологическая детекция;

б) культивирование селективных питательных сред;

в) определение по продукту гепа-мишепи.
Теперь немного подробнее.

Прямое определение нуклеотидной последовательности ДНК про­водят, как уже было сказано выше, либо по методу Максама — Гил­берта, либо по методу Сепгера. Их отличие заключается в следую­щем. В первом используется принцип химической модификации нук-леотидпых оснований ДНК с последующим выщеплепием олигонук-леотида по модифицированному остатку. Полученный набор корот­ких олигопуклеотидов с различными концевыми основаниями и раз­личной длины разделяют электрофоретически и идентифицируют при помощи радиоавтографии. В методе, предложенном Сепгером, набор коротких иуклеотидов получают не химической модификацией, а при помощи ДНК-полимеразной реакции. При этом вместе с обычными пуклеотидами в синтезе используют терминирующие дидезоксирибо-пуклеотиды.

В случае использования специфических зондов для идентифика­ции гена-мишени используют однонитевую ДНК или РНК, компле­ментарную данному гену. В эту ДНК (РНК) вводят радиоактивную метку по 5'-копцу (³²Р). Затем проводят гибридизационный анализ с последующей идентификацией гибридных дуплексов.

Вторая рассматриваемая группа основана на идентификации при­знака, кодируемого геном, и включает следующие методы.

A. Непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок (про­
дукт встроенного гена). При этом идентифицируется белковый про­
дукт, для чего используются иммунологические методы или методы
определения его специфической активности.

Или идет отбор клеток, образующих соединение, в синтезе кото­рого участвуют ферменты, кодируемые встроенным геном. Так, на­пример, отбирали дрожжи, синтезирующие гистидин, из популяций клеток, трансформированных смесью химерных плазмид.

Б. Использование селективных сред, поддерживающих рост только тех клеток, которые получили ген-мишень. Например, если встроен геи (3-галактозидазы, то клетки можно отобрать на среде с лакто­зой.

B. Иммунологическая детекция. Например, если в клетку встроен
ген человеческого белка — интерферона, то трансформированные
клетки можно отобрать при помощи антител к этому белку. Для
обнаружения антигенов в бактериях путем скрининга на основе спе­
цифического их взаимодействия с антителами часто используется
метод, разработанный Брумом и Джилбертом. Для этого пластико­
вый диск покрывают слоем специфических радиоактивных антител
и помещают его на предварительно лизированные колонии. Антиге-

пы из лизироваппых бактерий связываются с антителами на диске. Их положение определяют с помощью радиоавтографии.

Для выявления специфического клопа в составе геномных или кДНК-библиотек, а также при количественном определении ДНК или РНК используются различные типы молекулярных зондов. Как пра­вило, зонды (пробы) — это фрагменты ДНК или РНК, содержащие меченые ³²Р-пуклеотиды. Работа с ними основана па их способности узнавать комплементарные последовательности в молекулах ДНК или РНК. Синтезированная на матрице специфической мРНК кДНК мо­жет быть использована в качестве зонда при скрииировапии геном­ной библиотеки. Один из наиболее распространенных методов поис­ка специфических последовательностей основан на применении син­тетических олигонуклеотидов, последовательность нуклеотидов в ко­торых подбирается по аминокислотной последовательности неболь­шого участка искомого белка с учетом вырожденности кода. При условии точного совпадения последовательности, длины олигоиуклео-тидного зонда в 15 — 20 звеньев оказывается достаточно для досто­верной гибридизации и обнаружения уникального гена. Такие зонды используются также для выявления после электрофореза специфи­ческих фрагментов ДНК или РНК и переноса их на нитроцеллюлоз-ный фильтр (методы «Саузерп-блоттииг» и «Нозери-блоттинг» соот­ветственно).

Нозери- и вестерн-разновидности блоттинга используются для определения молекулярных размеров и количества специфических РНК и белковых молекул.

Для идентификации и выделения интересующих исследователя клонов разработан метод гибридизации в бактериальных колониях или фаговых бляшках. На колонии бактерий, выращенных на твер­дой среде, сначала накладывают нитроцеллюлозный фильтр. Бакте­рии прилипают к нему. После лизиса и денатурации под действием NaOH и фиксирования денатурированной ДНК прогреванием фильтр инкубируют в растворе с радиоактивно меченым зондом. По оконча­нии гибридизации его отмывают от избытка зонда. Далее выявляют образовавшийся меченый гибридный комплекс путем контакта с рент­геновской пленкой. Сравнивая положение пятна на радиоавтографе с положением колоний на чашке, выбирают ту группу бактерий, кото­рая дала положительный сигнал. Аналогичным образом поступают и при идентификации клонов на основе фаговых векторов. Результа­том этих манипуляций является выделение искомых индивидуаль­ных клонов (бактериальные колонии или фаговые бляшки).