С помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ревертазы)

Это наиболее популярный метод синтеза генов. Матричной РНК обычно много в клетках, специализирующихся на синтезе определен­ного белка. Она не содержит интронов соответствующих генов, по­этому может транслироваться в бактериальной клетке. Обратная тран-скриптаза — РНК-зависимая ДНК-полимераза — образует копии ДНК с геномов мРНК.

В генетической инженерии обычно используют фермент, кодиру-

емый вирусом миелобластоза птиц. Для получения полноразмерной копии гена с мРНК необходим праймер. Так как все мРНК на З'-кон-це несут полиадениловую последовательность, то в качестве праимера используют присоединяющийся к ней олигонуклеотид (политимиди-новую последовательность). Далее, используя его, ревертаза синтези­рует на матрице мРНК однонитевую ДНК-копию. По непонятным причинам в конце мРНК обратная транскриптаза, копируя часть кДНК, образует однонитевую петлю с З'-ОН-концом. Далее щелочью гидро-лизуют мРНК и приступают к синтезу второй нити кДНК. Прайме-ром для этой цели служит З'-ОН-конец петли. Полимеризацию ведут последовательно ДНК-полимераза I и обратная транскриптаза. На заключительном этапе с помощью нуклеазы SI гидролизуют петли и получают полноразмерные двухнитевые копии генов.

Преимущество рассматриваемого метода состоит в том, что ген получается без интронов и других нетранскрибируемых последова­тельностей. Также в том, что легче создать условия, когда клетка ак­кумулирует нужный вид мРНК, чем отбирать ген из смеси фрагмен­тов ДНК. Недостатком является то, что синтезируемые структурные гены получают без необходимых для их функционирования регуля-торных элементов. Синтез последних может быть достигнут получе­нием ДНК-копий не мРНК, а про-мРНК либо путем подстановки по­лученного структурного гена под контроль регуляторных элементов клетки-хозяина.

Вторым этапом получения нужного гена является постановка его на контроль регуляторных элементов клетки-хозяи­на или того вектора, которым будут трансформировать клетку-реци­пиент. Известно, что структурная организация участков инициации транскрипции и трансляции отличается у про- и эукариот, а также у высших и низших (дрожжи) эукариот. Поэтому ферменты микроор­ганизмов не способны эффективно и правильно использовать регуля-торные элементы высших организмов. К осуществлению эффектив­ной экспрессии чужеродных генов у микробов существует три подхо­да.

Наиболее простой вариант — внедрение чужеродного гена внутрь структурного гена. В этом случае бактериальная или дрожжевая клетка использует регуляторные элементы собственного гена. Един­ственным условием такого конструирования является то, что встрой­ка чужеродного гена должна быть осуществлена в правильной рамке считывания.

Недостатком данного метода является производство клеткой хи­мерного белка, из которого нужный продукт выделяют методом хими­ческого расщепления. Способ применим для получения ряда продук­тов, особенно небольших пептидов, таких, как соматостатин. Послед­ние пептиды часто являются нестабильными продуктами из-за актив­ного протеолиза. Важно, что в составе химерных белков стабильность пептидов повышается.

Второй метод — метод прямой экспрессии. В этом случае сты­ковка структурного гена производится в области инициации трансля­ции с образованием гибридного сайта узнавания рибосомами. Такой способ позволяет получать почти естественный чужеродный белок, обычно с лишним ме.тиониновым остатком на NH₂-KOHue полипептид­ной цепи. Последнее обстоятельство связано с тем, что многие необхо­димые нам белки человека, такие, как инсулин или интерфероны, син­тезируются в виде предшественников с сигнальной последовательно­стью на NH₂-KOH4e, которая отщепляется в процессе их выхода из клетки. Правильный процесс отщепления сигнальных последователь­ностей в бактериальной клетке не всегда возможен, поэтому в конст­рукцию вводят перед структурным геном кодон инициации трансля­ции (Met ATG):

старт мРНК

ATG......................... стоп

Met кодон

структурная часть чужеродного гена

J

гибридный участок связывания рибосом

Третий метод — метод «гибридного оперона» с частично пере­крывающимися генами. При этом чужеродный ген встраивается за начинающим геном оперона таким образом, что сайт инициации транс­ляции первого перекрывается на один нуклеотид сайтом терминации трансляции второго. В этом случае рибосомы, начавшие трансляцию первого белка, терминируют его синтез, но не покидают матрицу, а приступают к трансляции чужеродного белка. Ген первого белка опе­рона не является необходимым, а следовательно, в его структурную часть можно ввести дополнительный сайт связывания с рибосомами. Это обеспечит трансляцию чужеродного белка даже с большей эф­фективностью, чем первого белка оперона:

старт мРНК

участки связывания рибосом