Генно-инженерные работы в области биологической фиксации азота

Существует два способа обеспечения растений азотным питанием de novo: биологический (фиксация молекулярного азота живыми организмами) и химический (внесение азотных удобрений). Второй из них — более дорогостоящий и опасный, так как ухудшает экологи­ческую обстановку. Биологическую фиксацию осуществляют в ос­новном симбиотические микроорганизмы, что ограничивает ее приме­нение в интенсивных сельскохозяйственных технологиях. В настоя­щее время известны четыре главные системы симбиоза: Rhizobia — бобовые, Azolla-Anabaena — рис, Actinomyces — деревья, Spirillum — травы.

Из всех известных в настоящее время азотфиксаторов лучше всего изучены ризобии, образующие симбиоз с бобовыми растения -

ми. У них гены, вовлеченные в процесс азотфиксации, обозначаются индексами nif и fix. Первые кодируют ферменты и факторы нитроге-иазного комплекса, вторые¹ — все остальные гены, продукты которых участвуют в азотфиксации. Кроме того, большое значение имеют гены sym: они определяют симбиоз между растением и ризобиями и фор­мирование клубеньков. Установлено существование hsn-генов, кото­рые определяют видовую специфичность взаимодействия ризобий с данным видом бобовых, и enf-генов, повышающих эффективность образования клубеньков. Есть и другие гены, однако они еще мало изучены.

Гены азотфиксации и их регуляция. Область nif-генов состоит из 17 генов, организованных в 8 единиц транскрипции (оперонов). В настоящее время установлены функции отдельных генов этой обла­сти.

Два регуляторных гена А и L сгруппированы в одном опероне и кодируют белки, определяющие экспрессию всех других nif-onepo-нов.

Продукт nif А-гена — р-фактор РНК-полимеразы — активатор транскрипции всех других генов, а продукт nif L-гена подавляет транс­крипцию всех других генов при наличии в клетках большого количе­ства доступного азота, а также при высокой концентрации кислорода.

Регуляцию активности nif AL-оперона осуществляют гены ntr-сис-темы. Активация AL-оперона идет за счет действия продуктов ntr A-и ntr C-, а репрессия — за счет продуктов ntr В- и ntr С-генов. Центральным ферментом группы nif-генов является нитрогеназпый ферментный комплекс, осуществляющий восстановительную фикса­цию азота и состоящий из двух компонентов. Компонент I — тетра-мер, состоящий из двух а- и двух Р-субъединиц, которые кодируются nif D- и nif К-генами соответственно. Эти субъединицы ассоциирова­ны с MoFe-кофактором, который способен восстанавливать не только N₂, но и другие молекулы с тройными связями (типа ацетилена, циа­нида). Компонент II состоит из двух идентичных субъединиц, коди­руемых nif Н-геном, и осуществляет гидролиз АТФ, обеспечивая энер­гией процесс азотфиксации. Продукты генов nif F (синтез флаводок-сина) и nif J обеспечивают электронный транспорт от пирувата к флаводоксину, генов nif M и nif S участвуют в активации кофактора компонента II или его модификации, генов nif В, N и Е необходимы для синтеза активной формы компонента I. Продукт nif Q-гена обес­печивает включение Мо в комплекс FeMoCo. Функции остальных генов не установлены, и иногда их причисляют к fix-генам.

Генно-инженерные работы в области биологической фиксации азота. Основная часть генов nif-области является высоко консерва­тивной. При трансгенозе в другие виды бактерий продукты этих генов легко вписываются в метаболизм гетерологического хозяи­на. Так, в рекомбинантной Е. coli (родственной азотфиксаторам) в анаэробных условиях имелись нормальная экспрессия nif-генов и

успешная азотфиксация. Попытались переносить nif-геиы аэробных азотобактерий в клетки и других почвенных микроорганизмов, одна­ко пока неудачно.

Наряду с трансгепозом nif-геиов в бактерии разрабатывается гешю-инжеиерный проект по переносу nif-фуикций в высшие расте­ния, чтобы обеспечить связывание азота непосредственно в расти­тельных тканях, независимо от наличия особых симбиотических орга­низмов.

Симбиотические отношения между ризобиями и их естественны­ми бобовыми партнерами определяются сложной системой sim-гепов, перенос которых клеткам Agrobacterium tumefaciens (способны ин­фицировать широкий круг двудольных растений) привел к формиро­ванию клубеньков, но в последних отсутствовали некоторые структу­ры, бактероиды, не было азотфиксации. Помимо бактериальных генов в формировании клубеньков, образовании бактероидов и последую­щей фиксации азота участвует ряд генов растений. Основные расти­тельные белки, участвующие в нормальном течении симбиогепеза, — леггемоглобииы, подулины.

Функции леггемоглобииа:

1) обеспечение низкой концентрации кислорода в клубеньке;

2) поставка в клубеньки связанного кислорода, необходимого
для системы окислительного фосфорилироваиия бактероида.

Функции иодулинов:

1) транспорт восстановленного азота из клубеньков в растение;

2) поддержание структурно-функциональной организации клу­
беньков и обеспечение особого состояния бактероида.

Гены, кодирующие леггемоглобииы, можно переносить из одного вида растений в другой. Гены нодулинов не клонированы.

Более частной генно-инженерной задачей, доступной для решения в ближайшем будущем, станут повышение эффективности существу­ющих систем азотфиксации с помощью известных приемов, основан­ных па увеличении дозы гена, усилении транскрипции тех генов, про­дукты которых образуют узкое место в каскадном механизме азот­фиксации, путем введения более сильных промоторов, а также увели­чение КПД самой нитрогеназной системы, создание новых симбион­тов.

Исходя из этого главными целями генно-инженерных и селекцион­ных работ, проводимых в области биологической фиксации азота, па данный момент являются создание штаммов ризобий с усиленной азот-фиксацией и колонизирующей способностью и селекция растений в расчете на встречное получение культиваров с высокой способно­стью к симбиогенезу и обеспечению эффективной фиксации азота симбионтом.

Применение традиционных методов селекции и скрещивания в сочетании с приемами клеточной инженерии позволило получить ряд культиваров бобовых растений с заметно увеличенной способ-

иостыо поддерживать азотфиксацию. В настоящее время осуществле­на попытка применить культивары, не образующие клубеньков с ме­стными штаммами ризобий, но колонизируемые высокопродуктивны­ми лабораторными вариантами. Перспективны получение новых ви­дов симбиоза между существующими видами азотфиксирующих мик­роорганизмов или вновь созданными рекомбинаитными штаммами, с одной стороны, и растениями — с другой, трансгеиоз генов бобовых, ответственных за симбиогенез в другие виды растений, например, в злаки. Были предприняты попытки создать более тесные отношения между злаками и слабо ассоциированными с ними видами азоспи-рилл.