Бактерии рода Escherichia грамотрицательные, палочковидные бактерии. Эти бактерии являются факультативными анаэробами. Штамм DH5б один из наиболее часто используемых штаммов для технологии рекомбинантной ДНК. Штамм DH5б был разработан Ханаханом в лаборатории для экспериментов по клонированию. Этот штамм был разработан с содержанием нескольких мутаций, которые позволяют отбирать высокоэффективных трансформантов. Эти мутации обладают различными характеристиками.
Мутация recA1 снижает уровень гомологичной рекомбинации, что обеспечивает большую стабильность вставки. И является желательным, так как любой вектор, имеющий вставку может дестабилизироваться общей рекомбинации в клетке реципиента.
Мутация deoR позволяет бактериям расти на минимальной среде, которая содержит один источник углерода (инозин), а также обеспечивает эффективную вставку больших фрагментов ДНК, что может быть полезно при построении генных библиотек для больших фрагментов.
Мутация gyrA96 необходимадля штаммов, используемых для клонирования, так как продукт гена GyrА, ДНК-гиразы могут привести к делеции между прямыми повторами, эти повторы могут произойти и в клонированной вставке в плазмиде.
Мутация lacZДM15 деактивирует активность LacZ в бактериях, которые продуцируют неактивную форму в - галактозидазы. Штаммы с этой мутации не усваивают X-gal и остаются бесцветными на среде содержащей этот реагент. Но если плазмида имеет LacZ альфа-субъединицу (например, PUC - плазмиды) и эту плазмиду трансформируют в клетку, она дополняет ген LacZ и в - галактозидаза образуется. Поскольку альфа - субъединицы находятся рядом с сайтом множественного клонирования (MCS) векторов pUC, вставка в MCS будет нарушать альфа-субъединицу и колонии, которые будут содержать данную вставку будут белые, а колонии без вставки синие.
|
|
Этот штамм кишечной палочки был использован в недавних исследованиях, для хранения цифровых данных[5], [8].
Среды и реактивы
Бактериальную культуру выращивали в на плотной питательной среде (полноценный агар). Агаризованная среда содержала 1,5% агара, источником углерода была глюкоза в конечной концентрации 0,2%. Аминокислоты, основания и витамины добавляли в концентрации 20, 10 и 1 мкг/мл соответственно.
Питательный бульон
| Питательный бульон для культивирования микроорганизмов (панкреатический гидролизат рыбной муки) | 20 г. |
| Дистиллированная вода | 1 л |
| Доводили pH 90 7,0-7,2 Стерилизовали путём автоклавирования при 0,5 атм 45 минут |
Агаризованная полноценная среда (на основе рыбного гидролизата)
| Питательный бульон для культивирования микроорганизмов | 15 г. |
| Смесь аминокислот | 5 г |
| Агар-агар | 15 г. |
| Дистиллированная вода | 1 л |
| pH до 7,0-7,2 Стерилизовали путём автоклавирования при 0,5 атм 45 мин |
ТЕ-буфер (pH 7.4) 50 мл
| Состав раствора | Стоковый раствор | Количество |
| 10 мМ Tris pH 8.0 | 1М | 0,5 мл |
| EDTA1 мМ pH 8.0 | 0,5М | 0,1 мл |
| Дистиллированная вода | до 50 мл |
Отмывающий раствор
| Состав раствора | Стоковый раствор | Количество |
| Tris 25мМ pH 8.0 | 1М | 12,5 мл |
| EDTA 10мМ pH 8.0 | 0,5М | 10,0 мл |
| NaCl 150мМ | 5М | 15,0 мл |
| Дистиллированная вода | До 500 мл |
Раствор 1 для выделения плазмидной ДНК. (200 мл)
| Состав раствора | Стоковый раствор | Количество |
| Глюкоза 50 мМ | 2 М | 5 мл |
| EDTA 10мМ pH 8,0 | 0,5 М | 4 мл |
| Tris 25 мМ pH 8,0 | 1,0 М | 5 мл |
| Лизоцим E. coli 3 мг/мл | 0,6 г (добавлять перед использованием) | |
| Дистиллированная вода | до 200 мл (186 мл) |
|
|
Раствор 2 для выделения плазмидной ДНК. (30 мл)
| Состав раствора | Стоковый раствор | Количество |
| NaOH 0.2 н | 2н NaOH | 3 мл |
| SDS 1% | SDS 10% | 3 мл |
| Дистиллированная вода | До 30 мл (24 мл) |
Раствор 3 для выделения плазмидной ДНК. (100 мл) pH 4,8
| Состав раствора | Количество |
| Ацетат калия (натрия) 5М | 60 мл |
| Ледяная уксусная кислота | 11,5 мл |
| Дистиллированная вода | 28,5 мл |
X-gal 20 мг/мл
| Состав раствора | Количество |
| Х-gal | 65.2 мг |
| раствор DMFA | До 3,26 мл |
IpTg100 мМ (23,83 мг/мл)
| Состав раствора | Количество |
| IpTg | 238.4 мг |
| Деионизированная вода | до 10.4 мл |
Приготовление 0,7% агарозы
| Агароза | 0,7г |
| TАЕ - буфер | 100 мл |
| Нагреть до полного расплавления агарозы, охладить до 50-60оС. |
10Х ТАЕ - буфер pH = 7.6
| Tris основной | 24,2 г |
| Ледяная уксусная кислота | 5,71 мл |
| 0,5 ЭДТА, рН 8 | 10 мл |
| Дистиллированная вода | До 500 мл |
В работе использовался коммерческий препарат антибиотика ампицилин в концентрации 10000 мкг/мл. Аммпицилин растворяли в стерильной воде. Изопропилтио в - галактозид (IPTG) и в-галактозиаду (X-Gal) производства «MBI Fermentas» (Литва) готовили в соответствии с рекомендациями изготовителя и использовали в концентрации 100 ммоль/л и 20 мг/мл соответственно.
Методы исследования
Манипуляции с ДНК
Тотальную ДНК использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции. Рестрикцию ДНК и последующее лигирование фрагментов осуществляли в условиях, рекомендуемых фирмой изготовителем ферментов «MBI Fermentas» (Литва). В качестве реперной ДНК при определении размеров рестрикционных фрагментов использовали синтетический репер 1 kb ladder (Fermentas, Литва))
|
|