Плазмидную ДНК из бактерий E.coli выделяли методом щелочного лизиса. Выделение производили из ночной культуры E.coli, которую выращивали при 37 ОС.
Использовали растворы следующего состава: лизирующие (буфер I: 50 мМ глюкоза, 10мМ EDTA, 25 мМ Tris, лизоцим в концентрации 3 мг/мл; буфер II: 0,2н NaOH, 1% SDS) и нейтрализующий (3М ацета K, pH4,8). ДНК осаждали изопропанолом и ресуспендировали в 200 мкл ТЕ буфера (10 мМ Tris pH 8.0, 1 мМ EDTA pH 8.0), дальнейшую очистку препарата ДНК вели с использованием12 моль/л LiCl.
Трансформация бактерий
Трансформацию бактерий E.coli осуществляли кальциевым методом. К клеткам предварительно переведённых в состояние компетентности добавляли ДНК в концентрации до 1 мкг.
1) Бактериальную культуру выращивали в течении ночи на питательном бульоне.
2) Ночную культуру разводили в 25 раз.
) Далее доращивали до log-фазы на качалке 200-250 оборотов 37 ОС до 2 часов.
) Бактериальную культуру переносим в стерильные эппендерфы по 1,5.
5) Центрифугировали 5000 об/ мин 5 мин 4оС
6) Супернатант удаляли, осадок мягко ресуспендировали в 100 мкл 0,1М CaCl2. Эппендорфы оставляли на лядяной бане на 1 час для достижения компетентности.
) К компетентным клеткам добавляли в концентрации ДНК до 1 мкг и оставить в тех же условиях на 30-45 минут.
) Осуществляли температурный шок: 40оС - 30 сек + 2 мин на ледяной бане.
) В эппендорфы добавляли 1 мл питательного бульона, и помещали на качалку на 30 мин, 200-250 оборотов 37оС для экспрессии.
) Центрифугировали 5000 об/мин 5 мин.
) Производили высев на чашки с селективной средой содержащей ампициллин в концентрации 50 мкг/мл, IpTg в концентрации 0,5 ммоль/л, Х-gal в концентрации 0,1 мг/мл.
) Учёт результатов производили через 24 часа.
Электофоретический анализ
Электофоретический анализ ДНК осуществляли общепринятыми методами. Для продуктов использовали 0,7% агарозный гель и ТАЕ-буфер. Для визуализации фрагментов ДНК использовали бромистый этидий (добавляли в буфер) в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Для нанесения проб использовали буфер следующего состава: 40% сахароза, 0,25% бромфенеловый синий. Гель фотографировали, используя
Размер фрагментов ДНК устанавливали на основании их электрофоретической подвижности в агарозном геле, в качестве реперной ДНК использовали 1 kb DNA Ladder (Fermentas, Литва)
Полимеразная цепная реакция
При постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали набор FermentasTM (Литва) и амплификатор Thermo scientific Pico 24 Thermal Cycler.
Реакционную смесь для ПЦР готовили в объёме 20 мкл, состав реакционноё смеси представлен в таблице 2.
Таблица 2.2 - Состав реакционной смеси для полимеразной цепной реакции
| Компонент | Объём (мкл) | Исходная концентрация | Конечная концентрация |
| ДНК | 1-4 | - | 0,1-5 нг/мкл |
| Праймер 1 | 10 мкмоль/л | 0,5 мкмоль/мл | |
| Праймер 2 | 10 мкмоль/л | 0,5 мкмоль/мл | |
| Буфер | 10Х | 1Х | |
| Смесь dNTP | 2 ммоль/л | 0,2 ммоль/л | |
| ДНК-полимераза | 0,06 | 5 ед/мкл | 0,0025 ед/мкл |
| mQ вода | до 20 мкл | - | - |
Фрагмент бактериальной хромосомы B. subtilis размером 885 п.н., содержащий гены tmrB и aroK - амплифицировали с помощью праймеров ShikF-NotI (5’ - GCGGCCGCCATTAGTGTAAAGTGGTGAAC-3’) и ShikR-BamH1 (5’ - CCGGATCCGCCCAGAGATACGATTTTG-3’) при режиме амплификации: 94 ОС - 5 минут (один цикл); 94 ОС - 30 секунд, 54 ОС - 5 секунд, 52 ОС-25 секунд, 94ОС-30 секунд, 54 ОС-5 секунд, 52 ОС-25 секунд, 68 ОС- 1 минута 30 секунд (10 циклов); 94 ОС-30 секунд, 54 ОС-30 секунд, 68 ОС- 1 минута 30 секунд, (20 циклов); 72 ОС - 5 минут. Праймеры содержали на 5’ - концах сайты для рестриктаз NotI и BamHI соответственно.
Результаты и обсуждение
Наиболее перспективным методом получения шикимовой кислоты является микробиологический синтез.
В общем пути биосинтеза ароматических соединений образующийся шикимат подвергается фосфолированию под действием шикиматкиназы с образованием шикимат-3-фосфата. Для накопления шикимата надо инактивировать данный фермент. Данный фермент кодируется геном aroI, который расположен достаточно далеко от остальных генов данного метаболитического пути. Одним из таких вариантов является постановка гена aroI под регулируемый промотор в составе бактериальной хромосомы. Данный метод позволяет регулировать уровень экспрессии гена в зависимости от стадии культивирования штамма-продуцента: индуцировать на ранних этапах роста культуры, позволяя ей проявлять свои прототрофные свойства и блокировать на поздних, вызывая накопление шикимовой кислоты.
Для амплификации целевого фрагмента, ограниченного генами tmrB и aroK, также содержащего регуляторные элементы указанных генов, кодирующие последовательности которых расположены на «-» и «+» цепи ДНК соответственно, использовали праймеры содержащие на своих 5’ концах навески с сайтами распознавания для рестриктаз BamHI и NotI.
Данный фрагмент амплифицировали с матриц штаммов В. Subtilis ВНИИгенетика-15 С10 и ВНИИгенетика-15 D4, размер данного фрагмента должен составлять 885 п.н.
Рисунок 3.1 - Электрофореграмма продуктов амплификации.
- продукт амплификации по матрице ВНИИгенетика-15 D4
- маркер1 kb DNA Ladder
- продукт амплификации по матрице ВНИИ генетика-15 С10
Так как концентрация продукта амплификации с матрицы ВНИИгенетика-15 D4 была больше, этот продукт использовался в дальнейшем работе.
Полученный продукт лигировали с ДНК плазмиды pMTL21C. C ДНК плазмиды предварительно осуществляли рестрикцию по сайту рестрикции SmaI. Лигированной смесью трансформировали клетки E. coli DH5a. Селекцию вели на полноценной питательной агаризованной среде, содержащий ампициллин в концентрации 50 мкг/мл, X-Gal, IPTG. Из клонов трансформантов, имеющих белую окраску выделяли плазмидную ДНК и проверяли путём рестрикционного анализа по сайту рестрикции BamHI.
С данным продуктом рестрикции осуществляли полимеразную цепную реакцию.
Таблица 3.1 - Лигирование вектора со вставкой
| Наименование реагента | Исходная концентрация | Желаемое количество / концентрация в конечном растворе | Объем реактива (добавляемый в пробирку) |
| ДНК вставки | 50 ng/µl | 91,7 ng | 1,3 µl |
| ДНК вектора | 50 ng/µl | 108,3 ng | 2,2 µl |
| 10x Ligation Buffer | 10X | 1X | 2.0 µl |
| T4 ligase | 10 u/µl | 5 u | 0.5 µl |
| H2O | до 20 µl | 14,02 µl | |
| Условия реакции: реакционная смесь оставляется на ночь при 4-8оС) Для инактивации фермента выдерживаем смесь 10 минут при 65°С. |
Суммарное количество ДНК в лигазной смеси - 200 ng
Отношение вектор / вставка = 1/3
Пусть x - масса вектора в ng, у - масса вставки в ng.
x+y=200 (y/1000)/(x/3543)=3=200-y y/1000=3*(200-y)/3543=91,7 нг x=108,3 ng
Рисунок 3.2 - Электофореграмма продуктов рестрикции по BamHI
1- маркер1 kb DNA Ladder
2- плазмида pMTL21C
- продукт рестрикции BamHI
- продукт рестрикции BamHI
- продукт рестрикции BamHI
- продукт рестрикции BamHI
Рисунок 3.3 - Электофореграмма продуктов амплификации по матрице BamHI
-плазмида pMTL21C
2 - продукт амплификации по матрице BamHI
Заключение
В ходе данной работы были получены ампликоны с матриц с матриц В. Subtilis ВНИИгенетика-15 С10 и В. Subtilis ВНИИгенетика-15 D4.
Осуществлено лигирование с ДНК плазмидой pMTL21C.
Осуществлена трансформация клеток E.coli DH5б.
Список использованной литературы
1. Бочков, Д.В. Исследование содержания шикимовой кислоты в некоторых ратениях Алтайского края/ Д.В Бочков, С.В. Сысолятин, А.И. Калашников, И.А. Сурмачёва // Химия растительного сырья 2011 №1. - с. 119-122
2. Бочков, Д.В. Поиск сырья для выделения шикимовой кислоты/ Д.В Бочков, С.В. Сысолятин, А.И. Калашников, И.А. Сурмачёва, А.А. Ламберова, А.С. Буянова, М.Э. Ламберова // Химия растительного сырья 2011 №3. - с. 81-87
3. Iwona Gientka. SHIKIMATE PATHWAY IN YEAST CELLS: ENzYMES, FUNCTIONING, REGULATION - A REVIEW // Iwona Gientka, Wanda Duszkiewicz-Reinhard // Рolish journal of food and nutrition sciences 2009, Vol. 59, No. 2, pp. 113-118
. Fengli Chen. Extraction and Chromatographic Determination of Shikimic Acid in Chinese Conifer Needles with 1-Benzyl-3-methylimidazolium Bromide Ionic Liquid Aqueous Solutions/ Fengli Chen, Kexin Hou, Shuangyang Li, Yuangang Zu, and Lei Yang // Journal of Analytical Methods in Chemistry Volume 2014 (2014), Article ID 256473, 12 pages.
. Malachi Griffith. Genetic Modification of the Escherichia coli Strain DH5б to Allow the Selection of Plasmids Carrying Complementary Yeast Genes // Projects in Biology 05.4111/6 Supervised by Dr. R.D. Gietz April 2, 2001
. Dewick, M. THE SHIKIMATE PATHWAY:AROMATIC AMINO ACIDS AND PHENYLPROPANOIDS/ M. Dewick // Medicinal Natural Products, 2002.
. Denis, V. Shikimic acid: review of its analytical, isolation, and purification techniques from plant and microbial sources/ Denis V. Bochkov, Sergey V. Sysolyatin, Alexander I. Kalashnikov, and Irina A. Surmacheva // J Chem Biol. Jan 2012; 5 (1): c. 5-17.
8. Интернет-портал DH5-Alpha E.coli [Электронный ресурс] - Режим доступа https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/DH5-Alpha_E.coli.
. Интернет-портал Шикиматный путь [Электронный ресурс] - Режим доступа https://www.pandia.ru/text/77/454/37664.php.
. Интернет-портал Осельтамивир (Тамифлю) [Электронный ресурс] - Режим доступа https://it-apharm.ru/oseltamivir.html.
. Интернет-портал Осельтамивир (Oseltamyvir): инструкция, применение и формула [Электронный ресурс] - Режим доступа https://www.rlsnet.ru/mnn_index_id_2869.htm
12. Hermann K.M. The shirimatepathway:early steps in the biosynthesis of aromatic compounds. // The Plant cell. -1995. Vol.7. - c. 907-919.
. Rangashari S., Fiedmay T.C., Hartvan G., Hemmiinghaus J.V., Kretzmer K.A. Processes for producing and recovering shicimic acid.: пат. WO 2009/052303 А2 СI2P 7/42 (2006.01).-опублю 23.04.2009.
. Brouns K.D. Regulation of aromatic amino acid biosyntesis in E.coli K12 // Genetics. - 1960. Vol.60. - c. 31-48
15. Panina E.M., Vitreschak A.G., A.A. Mironov and gelfand. Regulation of Aromatic Amino acid Biosyntesis in Gamma - Proteobacteria // J. Mol. Vicrobiol/ Biotechnol. - 2001.-Vol.33-/529-543
. Adachi O., Ano Y., Toyama H., Matsushita K. //High shikimate production from quinate with two enzymatic systems of acetic acid bacteria. Biosci. Biotechnol. Biochem.2006. Vol.70.
17. Ambhaikar N. Shicimic acid // Material of Group Meeting, 1.12.2005. - 2005.-7c.
. Frost J.W. Methods and materials for production of shicimic acid.: patent US 2007/0087424 A1, C12P 7/42, C12N 1/21, C07H21/04? C12n 15/74.-опубликовано 19.04.2007
. Johansson L., Lindskog A., Silfversparre G., Cimander C., // Shicimic acid production by modified strain of E.coli under phosphate-limited and carbon limited condition. //Biotechnology and Bioengineering.2005. Vol.92. No.5., p541-552.
. Escalante A., Calderyn R., Valdivia A., Anda R., Hernandez G., Ramfirez O.T., Gosset G and Bolivar F. Metabolic engineering for the production of shicimic acid in an evolved E.coli strain lacking the phosphoenolpyruvate:carbohydrate phosphotransferaze system. // Microbial Cell Factories. -2010.-Vol. 9. - c. 21.
. Iomantas Yurgis A.V., Abalkina E.G., Polanuer B.M., Yampolskay T.A., Bachina T.A., Kozlov Y.B. //Method for production shicimic acid // US6436664.2002-08-20.
. Chambers S.P., prior S.E., Barstov D.A., Minton N.P., The pMTL nic-cloning vectors. Improved pUC polylinker regions to facilitate the the use of nucleotide sequencing //Gene. - 1988.-Vol.68, №1.-с. 139-149
23. Интернет-портал E. coli genotypes [Электронный ресурс] - Режим доступа https://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes#DH5.CE.B1.