Высокая востребованность шикимовой кислоты и наличие широкого круга областей, где она может быть использована обуславливает постоянный поиск новых способов её получения. Наиболее популярны следующие способы получения шикимовой кислоты: химический синтез, выделение из растительного сырья, микробиологический синтез [16].
Первый успешный синтез шикимовой кислоты в лабораторных условиях был проведён в 1960 году. Далее были разработаны несколько модифицированных синтезов данного соединения, а также были применены новые схемы синтеза шикимата, в которых использовались широкодоступные и недорогие химические соединения. Но этот способ синтеза имеет ряд недостатков - высокая стоимость, низкий выход целевого продукта и высокая вероятность образования биологически неактивных изомеров. Эти недостатки ограничивают использование этого способа синтеза шикимовой кислоты [17].
Также шикимовую кислоту можно получать из растительного сырья. В настоящее время шикимовую кислоту выделяют из китайского звёздообразного аниса. Выход продукта составляет 3-7% от веса сухих семян, самый высокий из всех исследованных растений. Но данное растение сложно культивируется и достигает способности к образованию семян на шестой год. И для получения 1 кг кислоты надо 30 кг семян.
Известно, что многие автотрофы производят шикимовую кислоту, но её содержание в большинстве автотрофов низкое.
Поэтому продолжается поиски альтернативных растений для синтеза данного соединения. Недавно выделена чистая шикимовая кислота (выходы 2,4-3,7%) из семян Liqutdambar styracifina, которое растёт в изобилии в восточной части Северной Америки и Мексики. Её высокое содержание обнаружено и в листьях гингко (Gingo biloba) [1].
|
|
Было установлено, сто глифосат блокирует действие шикиматкиназы. Поэтому обработка данным гербицидом растений увеличивает выход шикимовой кислоты[13].
Но несмотря на то что методы выделения шикимовой кислоты постоянно совершенствуются, а также расширяется круг используемых растений, этот метод имеет ряд недостатков: является трудоёмким, поступление растительного сырья для выделения ограничивается сезоном года, когда содержание шикимовой кислоты максимально, и данного сырья недостаточно для удовлетворения существующих потребностей в шикимовой кислоте.
Поэтому наиболее перспективными методами в синтезе данного соединения является микробиологический синтез. На сегодняшний день одна треть от всего количества шикимовой кислоты получается путеё синтеза с использование сверхпродуцентов E. Coli.
Для создания микроорганизмов-сверхпродуцентов шикимовой кислоты применяется различные подходы. Например Джоном Фростом с коллегами был сконструирован штамм E.coli SP1.1/pKD12.112, дефектный по гену шикиматдегидрогиназы, продуктивность которого составила более 50 г. шикимата на литр культуральной жидкости. Но данные бактерии также секретировали в среду большое количество дегидрошикимата и хинной кислоты, поэтому для получения чистой шикимовой кислоты необходимо было производить трудоёмкую процедуру очистки[18].
Луиза Ёхансен с коллегами создали сверхпродуцент E.coli W3110.shik1 за счёт модификации гена aroL, который детерминирует образование фермента шикиматкиназы[19].
Адельфо Эскаланте в качестве исходного объекта исследования использовал штамм E.coli PB12, лишённые фосфоенолпируват карбогидрат фосфотрансферазной системы, но способный утилизировать глюкозу. Для повышения выхода шикимовой кислоты был проведён ряд генетических модификаций шикиматного пути и фосфотрансферазной системы. Производили инактивацию ФТС оперона (ptsHIcrr), экспрессию генов не связанных с ФТС транспортёров глюкозы и трансформацию плазмидами, несущими гены tktA и ppsA, кодирующие транскетолазу и ФЕП-синтазу для повышения доступности эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпирувата. Модификации шикиматного пути заключалась в блокировании синтеза шикимовой кислоты в хоризмат. Это было достигнуто инактивации генов aroK и aroL, а также за счёт введения генов, кодирующих белки aroF и aroG, не чувствительных к ретроингибированию. Этот штамм обеспечил выход продукта 71 г./л[20].
|
|
Сверхпродуценты шикимовой кислоты были созданы на основе Bacillus subtilis. За счёт увеличения числа копий генов, кодирующих шикиматдегидрогеназу и ингибирование генов, отвечающих за синтез шикиматкиназы. Были получены штаммы с выходом шикимата 14 г./л[21].