Цель заражения:
1) выделение вируса из патматериала
2) поддержание вируса в условиях лаборатории
3) наработка вакцин
4) биологическая модель для получения реакции нейтрализации
5) биологическая модель для титрования вируса
6) наработка интерферона
Требования, предъявляемые к инкубационному яйцу и куриным эмбрионам:
1 – яйцо должно быть из хозяйств благополучных по инфекционным болезням (СПФ – эмбрионы свободные от патогенной микрофлоры – если готовят вакцины, то яйца не из хозяйств)
2 – яйцо желательно получить от птиц белых пород (белая скорлупа – проще овоскопировать)
3 – яйцо должно быть снесено не более 6-10 суток
4 – яйцо должно быть оплодотворенным
Это один из наиболее доступных и удобных методов выделения вирусов. В лабораторной практике стал применяться в 30-е годы XX века.
Куриный эмбрион – это оплодотворенное куриное яйцо, в котором зародыш, находится на разных стадиях эмбрионального развития (на стадии бластулы или ранней гаструлы). Для заражения используется с 5-го по 12-й день инкубации (полный цикл развития эмбриона 21 день).
Данный метод широко применяется для идентификации вирусов, получения антигенов для приготовления вакцин и диагностикумов, определения титра вируса и т.д.
Имеет ряд преимуществ перед методом культивирования вирусов на лабораторных животных: скорлупа и подскорлупная оболочка надежно защищают эмбрион от бактериального заражения со стороны внешней среды; эмбрионы высокочувствительны к широкому спектру вирусов (это обусловлено наличием четырех различных питательных субстратов – желточного мешка, амниона, аллантоиса, хорионалланоисной оболочки); легкодоступны и экономичны, не требуют ухода и кормления.
Желательно использовать в работе SPF - эмбрионы (SPF – specific pathogen free - куриные эмбрионы свободные от патогенной флоры). Получают такие эмбрионы от кур с SPF – статусом. Такое качество может быть обеспечено при надлежащих “особо чистых” условиях содержания птиц (специальные птичники, стерильные корма, стерильный воздух, стерильная вода и т.д.).
Эмбрионы заражают в стерильных условиях. Предварительно отбирают жизнеспособные эмбрионы с хорошо выраженной подвижностью, для этого их просматривают в затемненной комнате на овоскопе. На скорлупе простым карандашом отмечают пугу (воздушную полость), ход крупных кровеносных сосудов и место предлежания эмбриона.
Перед заражением скорлупу обрабатывают спиртом и фламбируют. Заражают при помощи стерильных шприцов для туберкулинизации и специальных игл. Место заражения заливают парафином.
Учитывая патогенность исследуемых вирусов, работы ведут с соблюдением техники безопасности.
26. Методы заражения эмбрионов (рисунок куриного эмбриона), сбор вируссодержащего материала.
Заражение с 7 до 12 суточного возраста (куриный эмбрион развивается 21 сутки)
Вируссодержащий материал вводят в объеме 0,1-0,2 мл.
1) Заражение в аллантоисную полость
При заражении этим методом хорошо размножаются вирусы гриппа, ньюкаслской болезни, ринопневмонии лошадей, везикулярного стоматита и др. Существует несколько вариантов метода.
Первый вариант. Эмбрион фиксируют вертикально тупым концом вверх. В скорлупе на стороне зародыша, а иногда с противоположной зародышу стороны на 5–6 мм выше границы воздушной камеры делают отверстие диаметром около 1 мм. Иглу вводят параллельно продольной оси на глубину 10–12 мм. После инъекции вируссодержащего материала иглу извлекают, а отверстие в скорлупе закрывают каплей расплавленного стерильного парафина.
Второй вариант. Эмбрион фиксируют вертикально тупым концом вверх. Заражение проводят через центр воздушной камеры. Вируссодержащий материал вводят ниже отмеченной границы пуги на 0,5 см, проколов хорионаллантоисную оболочку. После инъекции исследуемого материала иглу извлекают, а отверстие в скорлупе закрывают каплей расплавленного стерильного парафина.
2) Заражение на хорионаллантоисную оболочку
Этот метод заражения куриных эмбрионов используют для культивирования эпителиотропных, нейротропных, дерматропных и пантропных вирусов (оспы, инфекционного ларинготрахеита птиц, чумы плотоядных, болезни Ауески, катаральной лихорадки овец и др.).
Заражение может быть выполнено через естественную или искусственную воздушную камеру.
- удаляют скорлупу в районе пуги, приподнимают подскорлуповую оболочку, вводят вируссодержащий материал. Должна быть стерильность – сверху на яйцо надевают стеклянный колпачок, края запаивают (в районе пуги).
- выпиливают треугольное отверстие на границе пуги и ХАО, поднимают подскорлуповую оболочку, вводят ВСМ, отверстие заклеивают стерильным пластырем
- заражение через искусственную пугу – под контролем овоскопа. Для заражения эмбрион фиксируют горизонтально зародышем вверх. В скорлупе делают два отверстия: одно небольшое по центру воздушной камеры (через которое в дальнейшем отсасывают воздух), а другое диаметром 0,2–0,5 см сбоку, со стороны зародыша. С этой целью в скорлупе выпиливают треугольник с длиной сторон около 1 см с помощью надфиля (напильничек) или зазубренным скальпелем. Пинцетом удаляют участок скорлупы и подскорлупной оболочки. После этого резиновой грушей через первое отверстие отсасывают воздух из естественной воздушной камеры. В результате через боковое отверстие внутрь проникает воздух, образуя искусственную воздушную камеру, дном которой является ХАО. После нанесения на ХАО исследуемого материала отверстие закрывают кусочком лейкопластыря обработанного 70º спиртом. Дальнейшую инкубацию эмбрионов, зараженных этим методом, проводят в горизонтальномположении боковым отверстием вверх.
3) Заражение в желточный мешок
Заражают эмбрионы 5–7-дневного возраста. Данный метод используют для размножения вирусов болезни Марека, катаральной лихорадки овец, ринопневмонии лошадей и др.
Используют два варианта заражения.
Первый вариант. Эмбрион фиксируют вертикально тупым концом вверх. В скорлупе по центру воздушной камеры делают отверстие и вводят иглу на глубину 3,5–4 см под углом 45° к вертикальной оси в направлении, противоположном месту нахождения зародыша.
Второй вариант. Для заражения эмбрион фиксируют горизонтально зародышем вниз. В скорлупе по месту прилежания желтка делают отверстие, которое после введения исследуемого материала заливают каплей расплавленного парафина.
4) Заражение в амниотическую полость
Заражают эмбрионы 6 - 11-дневного возраста. Метод используется при культивировании вирусов гриппа, ньюкаслской болезни, ринопневмонии лошадей и др.
За 2-3 дня до заражения эмбрионы рекомендуется инкубировать пугой вверх. В этом случае эмбрион и амнион смещаются вверх, что удобно для заражения.
Используют два варианта заражения.
Открытый способ. В скорлупе над воздушной камерой вырезают окно диаметром 1,5–2,5 см. Анатомическим пинцетом удаляют подскорлупную оболочку, захватывают амнион, подтягивают его к окну и вводят вируссодержащий материал. Отверстие в скорлупе закрывают лейкопластырем или стеклянным колпачком (края парафинируют).
Эмбрион инкубируют в вертикальном положении.
Закрытый способ. Заражение проводят в затемненном боксе под контролем глаза. Эмбрион фиксируют горизонтально зародышем вверх. В скорлупе по центру воздушной камеры делают отверстие, через которое вводят иглу с затупленным концом по направлению к зародышу. Легким толчком прокалывают амнион и иглу слегка оттягивают назад. Доказательством того, что игла проникла в амнион, служит движение тела зародыша в направлении передвижения. Затем вводят материал.
5) Заражение в тело эмбриона и головной мозг и в крупные кровеносные сосуды хорионаллантоисной оболочки.
Используют эмбрионы 7–12-дневного возраста. Известно два варианта метода.
Закрытый способ. Заражают так же, как в амнион, с той лишь разницей, что вируссодержащий материал вводят острой иглой.
Открытый способ. Заражают так же, как в амнион открытым способом. В скорлупе над воздушной камерой вырезают окно диаметром 1,5–2,5 см. Пинцетом подтягивают тело зародыша. Материал вводят в различные участки тела или непосредственно в головной мозг. При таких методах заражения бывает значительный процент неспецифической гибели эмбрионов от травм (до 30 % и более).
Заражение в крупные кровеносные сосуды хорионаллантоисной оболочки.Этот метод заражения применяется очень редко. При овоскопировании 11–13-дневных эмбрионов отмечают крупный кровеносный сосуд. По его ходу удаляют участок скорлупы. Материал вводят тонкой иглой в кровеносный сосуд по направлению тока крови. Удаленный участок скорлупы закрывают кусочком стерильного лейкопластыря.
В зависимости от метода заражения куриные эмбрионы инкубируют в вертикальном положении (заражение в аллантоис, амнион и желточный мешок) или в горизонтальном (заражение на хорионаллантоисную оболочку).
После заражения куриные эмбрионы ежедневно просматривают на овоскопе.
Погибшие эмбрионы помещают в холодильник с температурой 4°С до момента вскрытия. Гибель эмбриона в течение первых суток может быть обусловлена размножением грибов, бактериальной микрофлоры, внесенных в эмбрион вместе с инокулятом, по причине травмы или токсичности патматериала. Эта гибель считается неспецифической.
Эмбрионы инкубируют в зависимости от вируса от 2 до 7-8 сут. до момента максимального его накопления.
Затем все эмбрионы охлаждают при 4°С в течение 3–4 ч и вскрывают с соблюдением правил асептики в стерильных условиях бокса.
Скорлупу обрабатывают спиртом и фламбируют, срезают пугу. А затем отсасывают аллантоисную или амниотическую жидкость, собирают желток, извлекают оболочки и сам эмбрион. Тщательно осматривают на наличие изменений. Амниотическая жидкость в норме совершенно прозрачная, при заражении она может быть мутная, кровянистая. Характерные изменения, вызванные вирусом, бывают наиболее выраженными на хорионаллантоисной оболочке.
